两种小鼠结直肠癌动物模型的特点比较与应用

目的 建立炎症诱导和基因突变诱导结直肠癌小鼠模型并比较其特点。方法 采用氧化偶氮甲烷(azoxymethane, AOM)联合葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate, DSS)建立炎症诱导结直肠癌小鼠模型,使用KPC小鼠建立携带Kras基因突变和Apc条件敲除的转基因结直肠癌小鼠模型。观察小鼠体质量、粪便性状和便血等大体状况,根据建模时间点取材小鼠结直肠标本并观察其成瘤情况。HE染色及Ki67免疫组化评估病理变化。使用tdTomato标记CDX2阳性上皮细胞。培养并比较两种结直肠癌类器官与正常结肠类器官的差异。结果 AOM/DSS建模周期约50 d,其结直肠癌主要位于远段近肛门处和结肠中段;KPC模型形成结直肠癌约需8 d,肿瘤主要位于结肠近段。AOM/DSS模型中远段肿瘤部位组织结构紊乱,KPC模型中近段结肠黏膜层增厚且组织紊乱,存在大量未分化上皮细胞。AOM/DSS模型肿瘤组织内Ki67阳性细胞较癌旁组织中明显增多,KPC模型内近段结肠癌中存在大量Ki67阳性肿瘤细胞,远段结肠增殖水平正常。表达CDX2的tdTomato阳性上皮细胞主要位于结肠近段。两种模型均能培养得到增殖旺盛的肿瘤类器官。结论 AOM/DSS结肠癌模型具有慢性炎症所致结直肠癌特点,适用于慢性炎症相关结直肠癌的研究;KPC模型产生肿瘤的肠段及细胞增殖活性可能与CDX2高表达密切相关,适合Kras基因突变结直肠癌研究,两种结直肠癌模型可互为补充。

供体骨髓来源干细胞在骨髓嵌合小鼠肠上皮中定植和分化研究

目的观察骨髓移植后供体骨髓来源干细胞(bone marrowderived stem cells,BMDSCs)是否能够在受体肠上皮中定植并分化为肠上皮细胞。方法使用密度为1.073 g/mL的Percoll分离GFP转基因小鼠的骨髓有核细胞。利用60Co放射源对C57BL/6小鼠进行10 Gy致死剂量照射,照射后4 h经尾静脉移植绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)转基因小鼠骨髓细胞建立嵌合小鼠模型,移植后1月和6月取小肠标本石蜡包埋。使用GFP抗体鉴定GFP阳性供体细胞在小肠上皮的表达情况,并使用GFP抗体和细胞角蛋白(PCK)抗体进行双标以判断BMDSCs是否分化上皮细胞,同时结合绒毛蛋白(Villin)和GFP的免疫荧光双标及连续切片染色肠道特异转录因子CDX2和GFP来分析骨髓来源细胞是否分化为肠道功能性上皮细胞。结果供体骨髓来源细胞在嵌合鼠的骨髓和小肠上皮层中均有定植,且小肠上皮中GFP阳性细胞能够同时表达PCK、Villin和CDX2。结论供体骨髓来源干细胞可以在骨髓嵌合小鼠的肠上皮定植,并分化为具有正常功能的小肠上皮细胞。

局部解剖知识在放射性碘防护实验教学中的应用

防原医学主要探讨核武器爆炸以及核事故中因受到放射性核素暴露而引起的各类放射损伤机理及防护措施的学科。多数放射性核素对机体所造成的损伤效应通常具有明显的靶向性。放射性碘则主要蓄积于其特异性的危象器官甲状腺而引起损伤效应[1]。防原医学教学中我们特别注重结合放射性核素靶器官的解剖特征来讲解如何防护放射性核素所致危害,并取得了非常好的教学效果[2]。在此,我们以放射性碘防护实验教学为例,介绍局部解剖学知识在防原医学实验教学中的运用。

成年C57BL/6小鼠空肠Cajal间质细胞的分离、培养及鉴定

目的尝试优化体外培养成年小鼠小肠Cajal间质细胞的操作方法,为深入研究该细胞的生理功能提供一定细胞模型。方法 6～8周龄C57BL/6小鼠禁食24 h,无菌条件下截取3～5 cm中段空肠,分离平滑肌肌条并剪至小块后使用Ⅱ型胶原酶消化20 min,离心后进行组织块原代培养,观察不同时期细胞形态。使用c-Kit免疫荧光染色鉴定细胞表型是否为Cajal间质细胞。Fluo-3 AM染色细胞内钙,观察细胞能否自发产生钙离子振荡。结果分离所得组织不含空肠上皮和固有层组织,仅为小肠肌层。联合使用胶原酶消化和组织块原代培养能够较方便地培养出原代细胞,该细胞呈梭形,且具有细胞突起,彼此交织成网状。该细胞免疫荧光染色呈c-Kit阳性,平滑肌标志物SMA阴性。钙成像分析显示其能够产生钙离子振荡。结论联合使用酶消化和组织块培养能够较方便地培养出成年小鼠的空肠Cajal间质细胞,该方法为后续探讨Cajal间质细胞的生理功能及机制提供了一定的细胞模型。

防原医学实验课中培养学员创新能力的几点思考

创新能力是推动社会不断发展的根本动力,如何培养出基础理论功底扎实、创新能力强的医学专业本科生是现代医学本科教育必须认真思考的重要命题。实验课教学是联系理论与实践的桥梁,其不仅是对基础理论知识的强化与验证,

中枢神经系统H_2S的作用及机制研究进展

中枢神经系统内源性硫化氢 (H2 S)主要由胱硫醚 β 合酶合成。脑内H2 S对中枢神经系统多种生理和病理过程有重要的影响 :(1)H2 S通过cAMP途径 ,易化海马长时程增强的产生 ;(2 )H2 S通过下丘脑 垂体 肾上腺轴来参与神经内分泌功能的调节 ;(3)H2 S协同一氧化氮松弛脑血管平滑肌 ,从而调节血压。此外 ,H2 S还与脑血管损害。

骨髓移植后受体小鼠肠上皮内供体细胞的免疫电镜观察

目的探讨骨髓移植后供体骨髓来源干细胞(bone marrow derived stem cells,BMDSCs)是否能够在受体肠上皮分化为具有正常超微结构和功能的肠上皮细胞。方法使用Percoll液分离GFP转基因小鼠骨髓有核细胞,经尾静脉移植后3个月取材。标本经戊二醛固定,饿酸后固定,常规电镜超薄切片。采用包埋后染色免疫电镜技术以GFP抗体识别供体细胞,5nm胶体金标记二抗识别一抗后,进行电镜染色和观察。结果透射电镜下可见电子密度高的单个或成簇分布的球形胶体金颗粒散布于肠上皮细胞内,阴性对照组未见胶体金颗粒。阳性细胞主要为杯状细胞和吸收细胞,且阳性细胞同其他上皮细胞之间存在有细胞连接。结论通过免疫电镜技术证实,移植后的供体骨髓来源细胞可以在受体小肠组织中分化为具有正常功能的肠上皮细胞。

浅谈医学专业青年教师的教学能力培养

随着我国医学教育事业的不断发展,建设一支高素质医学专业青年教师队伍的重要性日显突出。在分析我国医学专业青年教师现状和特点的基础上,从激发青年教师对教育事业的热爱、建设有利于青年教师成长的外部环境和提高青年教师自身教学素质三个方面阐述如何帮助医学专业青年教师尽快提高教学能力。

骨髓源性干细胞的异质性及在肠道修复中的作用研究进展

目的对骨髓源性干细胞(bone marrow derived stem cells,BMDSCs)的异质性及其形成机制和意义进行综述,分析其在肠上皮重建中的作用和可能机制。方法查阅和分析近年有关BMDSCs异质性和其在肠上皮损伤修复中作用的相关文献,并作进一步综合分析。结果BMDSCs异质性可以解释其多向分化能力,可能以直接定植于肠道或通过和肠道干细胞融合以及促进损伤微环境的重建等多种机制参与肠上皮功能修复。结论BMDSCs在炎症性肠病等胃肠道损伤和修复中具有广阔的应用前景。

医学研究生创新能力的个人培养途径

当今社会对医学专业研究生创新能力的要求越来越高。在施教者努力创造有利于研究生创新能力培养外部条件的同时,医学研究生个人也必须认识到培养自身创新能力是时代对研究生的必然要求,树立创新意识,加强自我管理,注重从多方面提高自身的创新能力。

从日本福岛核电站事故谈防原医学教学改革

防原医学是军事预防医学的重要分支学科,主要内容涉及核武器和核事件所致放射损伤的临床表现、诊断和救治措施。随着社会实践的不断发展,越来越多的核相关事件(事故)需要运用防原医学知识进行处理,因此必须对防原医学教学进行相应改革以适应社会发展需要。近期发生的日本福岛核电站事故在全球范围内引起广泛影响和关注,结合此次核事故从教学理念、教学内容、教学形式和考评策略四个方面初步探讨如何进行防原医学教学改革。

运用组织学知识提高急性放射病教学效果

急性放射病（acute radiation sickness,ARS）是核武器爆炸以及核事故中因受到放射性核素过量外照射而引起的一种急性全身性疾病。在防原医学知识体系中,

自噬在小鼠皮肤创面修复中作用的初步研究

目的观察自噬在小鼠皮肤创面愈合中的发生情况,探讨其在创面修复中的可能作用。方法以GFP-LC3转基因小鼠制备皮肤后背部创面,在致伤后0、3、7、14 d取皮肤创面组织制作石蜡切片进行GFP免疫荧光染色标记自噬点,观察自噬在创面愈合过程中的动态变化;采用GFP抗体与α-SMA、F4/80抗体进行荧光双标,明确肉芽间质中发生自噬的主要细胞类型。而后将GFP-LC3小鼠分为自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)处理组与对照组,伤后连续10 d腹腔注射3-MA(10 mg/kg),动态观察创面大体愈合情况,在0、7、10 d取创面皮肤,组织学固定染色,评价自噬对创面愈合的影响;同时采用定量PCR(qRT-PCR)检测α-SMA、TGF-β1、PAI-1、Ⅰ型和Ⅲ型胶原等分子的mRNA表达,评价自噬对创面修复过程中胶原与胞外基质表达水平的影响。结果创面愈合过程中自噬水平先增强后逐渐回落,在增殖期(7 d)的自噬水平最高;肉芽角质细胞自噬强于间质细胞,肉芽间质中发生自噬的细胞主要为α-SMA阳性肌成纤维细胞;与对照组相比,3-MA处理组在伤后7 d与10 d创面肉芽的面积、宽度与表皮厚度差异均无统计学意义,而处理组7 d表皮基底细胞增殖活力增强(P <0. 05);两组α-SMA、胶原、TGF-β1与PAI-1等分子的mRNA水平差异均无统计学意义。结论皮肤创面愈合过程中增殖期存在高自噬水平,但抑制小鼠创面愈合过程中的自噬水平对创面愈合未见显著影响。

TBL结合CBL和LBL教学模式在防原医学教学应用中的体会

防原医学主要研究放射性损伤的医学防护及救治问题。放射性疾病临床表现各异,与其他非放射性疾病有许多相似之处,不易鉴别。如何选择合适的教学方法来激发学生的学习兴趣,提高学生的学习效率值得探讨。本文就目前较为热门以团队为基础的教学结合以案例为基础的教学和传统教学法这3种教学模式在防原医学教学中的应用,从防原医学教学方法、应用现状及具体实施过程谈点体会。

异体骨髓间充质干细胞在骨髓嵌合小鼠体内分化为肝细胞的实验研究

目的探讨小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)在体内分化为肝细胞的可行性。方法雌性C57BL/6J小鼠全身一次性接受10Gy60Coγ射线照射后立即接受同品系绿色荧光蛋白(green fluores-cence protein,GFP)转基因小鼠骨髓间充质干细胞移植。移植后1周、1、3个月取骨髓嵌合小鼠肝脏,石蜡切片行GFP抗体免疫组化,冰冻切片在荧光显微镜下观察GFP阳性细胞在肝内分布。石蜡切片行GFP抗体和白蛋白(albumin,Alb)抗体以及GFP抗体和细胞角蛋白18(cytokeratin18,CK18)抗体免疫荧光双标染色法,以此检测GFP阳性细胞在受体小鼠肝内的分化情况。结果移植后1周、1、3个月骨髓嵌合小鼠肝内皆可见GFP阳性细胞,且有随时间减少的趋势,并都可见GFP和Alb双阳性细胞。结论异体骨髓间充质干细胞可在骨髓嵌合小鼠体内分化为表达Alb和CK18的肝细胞,为肝组织的再生和修复提供了新思路。

hPDGF-A/hBD_2双基因共表达腺病毒载体的构建及表达

目的制备人血小板源性生长因子-A(human platelet-derived growth factor A,hPDGF-A)和人β防御素2(human beta defensins,hBD2)双基因共表达腺病毒载体并观察其在大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)中的表达。方法将hPDGF-A和hBD2通过内部核糖体插入位点(internal ribosome entry site,IRES)连接后,以同源重组的形式插入腺病毒表达载体,由人胚肾293细胞包装,获得有感染能力的重组腺病毒颗粒。重组病毒感染BMSCs后,用RT-PCR检测重组腺病毒的表达。结果①成功构建穿梭质粒pAdTrack-hPDGF-A-IRES2-hBD2。②成功构建重组腺病毒质粒pAdeasy-hPDGF-A-IRES2-hBD2。③293细胞包装获得有感染能力的重组腺病毒。④转染的BMSCs高表达hPDGF-A和hBD。结论构建了hPDGF-A/hBD双基因共表达腺病毒载体,证实其转染BMSC后的表达。

骨髓间充质干细胞在小鼠肝脏局部分化为肝细胞的实验研究

目的探讨小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)在肝内分化为肝细胞的可行性。方法腹腔注射丙烯醇致雌性C57BL/6小鼠全肝损伤后局部接受雄性同品系绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)转基因小鼠骨髓间充质干细胞移植。移植后3周取骨髓嵌合小鼠肝脏做冰冻切片,荧光显微镜下观察GFP阳性细胞在肝内分布,石蜡切片行GFP抗体和白蛋白(albumin,Alb)抗体免疫组化双标法检测GFP阳性细胞在受体小鼠肝内的分化情况。结果移植后3周小鼠肝内可见GFP阳性细胞,并可见GFP和Alb双阳性细胞。结论异体骨髓间充质干细胞可在小鼠肝内分化为表达Alb的肝细胞,为肝组织的再生和修复提供了新思路,显示了其在肝病治疗中的应用潜力。

回顾切尔诺贝利事故,探讨防原医学教学改革

防原医学是一门综合性很强的军事医学学科,主要研究战时核武器、核爆炸和平时电离辐射所致的人体伤害医学防护及其临床救治。它与基础医学、临床医学和军事医学等学科都紧密联系。随着核能在各领域的广泛使用,而核事故、核源丢失等情况时有发生,提醒着人们必须重视核技术的安全应用。切尔诺贝利事故已过去30年有余,但其造成的严重影响延续至今。回顾此次事故给当地和全球人们造成的严重影响,深刻反思此次事故,从教学理念、教学内容、教学方法和考核方式等方面探讨如何进行防原医学教学改革。

3D培养体系中不同肠上皮细胞株形成肠类器官潜能的比较及应用

目的比较不同肠上皮细胞株在3D培养条件下形成肠类器官的潜能及特点,为利用肠上皮细胞株培养肠类器官提供实验研究基础。方法使用IEC-6、CT26.WT、Caco-2三种肠上皮细胞株进行3D培养,分析不同细胞株形成肠类器官的潜能。流式分选获取Caco-2单细胞后使用Matrigel进行培养并测定其生长速度。比较2D和3D培养条件下Caco-2细胞中肠道干细胞标志物Lgr5、Olfm4及增殖标志物Ki67的mRNA表达差异。免疫荧光染色分析2D和3D培养时Caco-2细胞内Ki67阳性细胞及lamp1阳性溶酶体的分布特点。比较5 Gy和15 Gy照射后Caco-2来源肠类器官中TUNEL阳性细胞分布特点。结果 3D培养时,Caco-2细胞可形成肠类器官,而IEC-6和CT26.WT细胞不能形成肠类器官,且单个Caco-2细胞也可形成肠类器官。Caco-2来源肠类器官中肠道干细胞标志物Lgr5、Olfm4和细胞增殖标志物Ki67的mRNA表达水平较2D培养时显著降低(P<0.05),Ki67阳性增殖细胞较2D培养显著减少。Caco-2来源肠类器官中细胞内溶酶体呈极性分布,与小肠组织切片中溶酶体在肠上皮细胞内的分布一致。电离辐射可引起Caco-2来源肠类器官内细胞发生凋亡,且凋亡细胞比例与照射剂量密切相关。结论 Caco-2在3D培养时可形成与在体肠道结构和功能类似的肠类器官,为下一步进行胃肠道电离辐射研究和药物评价研究提供了更加稳定可靠的体外研究模型。

Lewis肺腺癌对小鼠肠道干细胞及其微环境的影响

目的探讨Lewis肺腺癌(Lewis lung cancer,LLC)对小鼠肠道干细胞及其微环境的影响。方法比较不同接种方式(皮下接种和静脉移植)在C57BL/6J小鼠肺部形成肺腺癌的能力差异。通过HE、BrdU免疫染色和qPCR检测LLC对肠道形态、增殖动力学、肠道干细胞及其微环境相关基因、肠上皮细胞紧密连接及炎症因子表达的影响。使用EdU染色评价LLC条件培养基(LLC-CM)对IEC-6细胞增殖的影响。使用LLC细胞和LLC-CM观察肺腺癌对肠类器官生长的影响。结果静脉移植LLC细胞较皮下接种荷瘤更易在小鼠肺部形成肺腺癌。肺腺癌导致绒毛和隐窝长度较对照组显著增加(P<0.01),BrdU阳性细胞数量和Ki67基因mRNA水平显著高于对照组(P<0.05)。LLC-CM可增加EdU阳性IEC-6细胞数量(P<0.05)。肺腺癌小鼠肠组织中肠道干细胞标志物基因(Lgr5、Olfm4、Axin2)表达水平显著下降,微环境相关基因(Wnt3)表达水平降低(P<0.05)。肺腺癌引起肠上皮ZO-1免疫染色以及ZO-1和OCLN mRNA表达显著降低,IL-1β和TNF-α的mRNA含量显著增加(P<0.05)。LLC细胞和LLC-CM均抑制肠类器官生长。结论Lewis肺腺癌能够破坏肠道干细胞及其微环境,为肺癌与肠道交互作用提供了新的实验依据。