鸡传染性支气管炎病毒分离株CK/CH/HD/171018的生物学特性及其全基因组序列分析

为了明确传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)分离株CK/CH/HD/171018的生物学特性,本研究对所分离IBV CK/CH/HD/171018株首先进行了HA检查阴性、侏儒胚阳性检查及致病性试验;随后设计了23对引物进行全基因组内部序列扩增及使用cDNA末端快速克隆技术获得3'和5'的精准序列,并与不同基因型的参考毒株全基因组进行同源性比对、构建遗传进化树进行基因分型及重组分析。结果显示:该毒株自然状态下无血凝性,接种SPF鸡胚可导致鸡胚发育迟缓并产生典型的侏儒胚现象,对3日龄SPF雏鸡的致死率为100%;CK/CH/HD/171018基因组全长为27 688 bp,结构为5'Cap-Replicase-S-3a-3b-3c/E-M-5a-5b-N-poly(A)3',其中3'有14个A;CK/CH/HD/171018属于QX基因型,该分离株在Gene1的2个位置有QX型野毒株和CK/CH/LSC/99I型野毒株的重组痕迹,属于QX强毒型IBV。本研究丰富了IBV的生物信息数据库,为进一步从分子水平研究IBV的流行情况、变异机制及致病特征等奠定了基础。

猪圆环病毒4型Cap蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为制备猪圆环病毒4型(PCV4)Cap蛋白单克隆抗体,以原核表达的重组Cap蛋白免疫6~8周龄小鼠,三次免疫后取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。利用亚克隆技术和间接免疫荧光(IFA)方法筛选到2株阳性单克隆杂交瘤细胞株,分别命名为5H9和2F3。间接免疫荧光和Western blot试验表明,2株单抗均能特异性识别293T细胞中特异表达的Cap蛋白,且5H9和2F3的IFA效价分别为1∶12 800和1∶6 400。亚类鉴定结果表明,两株单抗重链均属于IgG1,轻链类型为kappa型。本研究制备的抗PCV4 Cap特异性单抗,为PCV4检测方法的建立和流行病学调查提供了有效的生物材料,也为该病毒的分离鉴定与Cap蛋白功能的探究奠定了基础。

猪圆环病毒2型Cap蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达及在小鼠体内免疫特性研究

猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白基因是该病毒基因工程疫苗的重要目的基因,但其在大肠杆菌表达系统中的表达产物通常以包涵体形式存在,影响其作为亚单位疫苗使用的免疫保护作用。将ORF2基因密码子改造为大肠杆菌偏爱的密码子,或构建MPG与ORF2基因融合,分别克隆至表达载体p ET28a,再转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达。SDS-PAGE和Western blot结果证实改造后的PCV2 Cap蛋白基因实现了可溶性表达。将上述两种重组蛋白纯化后,分别与GEL01、ISA206或ISA15A三种佐剂混合配制疫苗,小鼠免疫保护试验结果证明,以GEL01为佐剂的两免疫组PCV2 ELISA抗体和中和抗体水平最高。攻毒试验结果显示,除ISA15A组外,其他各免疫组脾脏中PCV2含量都显著低于非免疫对照组,表明两种重组蛋白与佐剂GEL01和ISA206制成的疫苗可诱导产生一定水平的免疫保护作用,为PCV2亚单位疫苗的研制奠定了基础。