重组腺病毒5型-诺如病毒GⅡ.4型-VP1病毒样颗粒的表达及鉴定

目的 采用293T细胞表达重组腺病毒5型(recombinant adenovirus 5,rAd5)-诺如病毒(Norovirus,NoV)GⅡ.4型-VP1病毒样颗粒(virus-like particle,VLP),并进行鉴定。方法 将重组腺病毒质粒pAd5-eGFP及pAd5-NoV-GⅡ.4-VP1分别转染293T细胞,拯救获得重组腺病毒rAd5-eGFP和rAd5-NoV-GⅡ.4-VP1。rAd5-eGFP在293T细胞上连续传代,验证其载体功能。将rAd5-NoV-GⅡ.4-VP1在293T细胞上进行传代,NoV-GⅡ.4-VP1经表达及纯化后,自组装形成NoV-GⅡ.4-VLP,并进行Western blot、ELISA检测及电镜观察。结果 镜下观察各代rAd5-eGFP均可见绿色荧光,且亮度随代次增加而增强。各代rAd5-NoV-GⅡ.4-VP1收获液中均可见NoV-GⅡ.4-VP1蛋白表达,相对分子质量约58 900。NoV-GⅡ.4-VLP可与兔抗NoV-GⅡ.4-VP1血清发生特异性结合,具有与天然的NoV病毒颗粒相似构象,可有效识别志愿者唾液样本中的NoV受体;镜下观察,其形态完整,呈球状,直径为43.5~58.3 nm,颗粒表面有少数突起,可能为VP1自组装时暴露于颗粒表面的P结构域。结论 表达的重组腺病毒NoV-GⅡ.4-VLP具有完整的VLP结构和良好的特异性,有望用于NoV腺病毒载体疫苗的相关研究。

三株柯萨奇A10型候选疫苗株生物学特性及免疫原性研究

近年来CV-A10已成为手足口病的最主要的病原体之一。本研究对3株不同CV-A10毒株进行生物学特性及体液免疫原性比较分析,筛选最适的CV-A10灭活疫苗候选株。将2014年荆州(JZ)分离株CV-A10-L12、2019江苏沛县(PX)分离株CV-A10-195和CV-A10-300,作为候选疫苗株经10层Vero细胞工厂培养,蔗糖垫底离心、蔗糖梯度离心、氯化铯等密度梯度离心后收获病毒颗粒。对不同候选毒株的滴度、病毒实心颗粒(FP)和空心颗粒(EP)的产量和比例、氯化铯密度、形态及结构蛋白等生物学特性进行比较分析。将纯化后病毒颗粒经甲醛灭活后,免疫Balb/C小鼠评价免疫原性。三株CV-A10候选疫苗株细胞工厂培养、纯化后,收获了高纯度、含病毒结构蛋白、形态完整的EP、FP颗粒。按照细胞培养自然EP和FP比例混合后,免疫6周龄Balb/C小鼠。以同源和非同源的四株CV-A10毒株作为中和毒种,测血清中和抗体滴度,评价3个疫苗候选株的体液免疫原性。CV-A10-195/PX/2019株病毒颗粒产量及免疫原性高于CV-A10-300/PX/2019株,高于CV-A10-L12/JZ/2014株。CV-A10-195/PX/2019株作为三株CV-A10毒株中最适疫苗候选株,可用于单价CV-A10或含CV-A10的多价疫苗的研发。

多特征知识下的食品安全事件实体抽取研究

【目的】从大规模食品安全事件当中抽取食品安全事件实体。【方法】基于已发生的食品安全事件,结合情报学数据获取、标注和组织的方法,融合食品安全事件实体的多种分布特征知识,通过条件随机场模型,构建食品安全事件语料并从中抽取相应的实体。【局限】在食品安全事件实体抽取过程中所制定的特征模板在领域化迁移上具有一定的局限性。【结果】在已有1 500万字经过标注的食品安全事件语料的规模上,通过统计食品安全事件实体的内部和外部特征,基于条件随机场机器学习模型,构建了食品安全实体的抽取模型,该模型最高的F值达到91.94%。【结论】通过对食品安全事件实体抽取结果的分析,在食品这一领域化的语料上,基于条件随机场进行实体抽取是可行的。

基于大数据岗位需求的文本聚类研究

【目的】对大数据工作岗位需求文本进行挖掘,帮助大数据企业更精准地定位所需人才。【方法】抽取招聘网站上2017年第一季度关于"大数据"的工作岗位信息,使用TF-IDF并结合Word2Vec和K-means实现基于语义的聚类,并利用轮廓系数方法获取最佳聚类效果。【结果】利用抽取获得的实体对文本向量进行表达能够达到良好的聚类效果,最终将岗位需求文本分为工作能力要求、学历要求以及工作经验要求三类。【局限】各网站信息发布的格式不统一,数据清洗不够全面,对聚类效果产生影响;挖掘获取的招聘信息数据量不充足,使Word2Vec模型训练集较小,训练结果还有提升空间。【结论】根据聚类结果发现大数据岗位对学历要求不高、企业偏好有经验的但也不排除无经验的求职者、企业对职位素养要求要高于计算机技术要求等特点。

细胞嗜性差异的2株柯萨奇病毒A10型的构建与拯救

目的以Vero细胞及人横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma,RD)细胞嗜性差异的柯萨奇病毒A10型(Coxsackievirus A10,CV-A10)2个毒株为模板,分别构建感染性克隆,并完成病毒拯救,为CV-A10毒株的细胞嗜性研究奠定基础。方法分别扩增Vero^(+)/RD+及Vero^(-)/RD+细胞嗜性差异的CV-A10毒株基因组,在5′端引入T7启动子序列,3′端引入polyA尾及NotⅠ酶切位点。将扩增得到的基因组序列与线性化pBR322载体以无缝连接技术连接得到全长质粒,经线性化后分别与T7-RNA聚合酶表达质粒共转染RD细胞完成病毒拯救。通过病毒感染后细胞形态观察及间接免疫荧光试验,比较拯救毒株对Vero细胞嗜性的差异。结果成功构建了Vero细胞嗜性差异的CV-A10毒株2种感染性克隆,并在RD细胞内完成病毒拯救,序列测定结果表明拯救毒株与亲本毒株序列一致。拯救毒株rCV-A10-010195能够有效感染Vero细胞并形成典型的细胞病变(cytopathic effect,CPE),而rCV-A10-3482无法有效感染Vero细胞。结论建立了2株Vero细胞嗜性差异的CV-A10毒株反向遗传操作系统,为CV-A10毒株细胞嗜性的研究奠定了基础。

SARS-CoV-2非结构蛋白兔抗血清的制备及其在灭活疫苗质量监控中的应用

目的制备SARS-CoV-2非结构蛋白1(non-structure protein 1,NSP1)兔抗血清,并用其检测SARS-CoV-2NSP1在灭活疫苗生产过程中的含量变化,为建立灭活疫苗纯度、工艺质量监控方法奠定基础。方法选择带DE3的E.coli原核表达系统表达SARS-CoV-2 NSP1全长蛋白,纯化后免疫日本大耳白兔,共免疫6次,每次间隔14 d,采集全血,获得NSP1兔抗血清;以纯化的NSP1蛋白为抗原,Western blot法鉴定兔抗血清纯度,同时利用RD细胞表达NSP1-eGFP融合蛋白,裂解后作为抗原对NSP1兔抗血清进行特异性鉴定;以SARS-CoV-2灭活疫苗生产过程中1~4 d细胞裂解液及纯化后病毒颗粒为抗原,NSP1兔抗血清及M、S、E、N兔抗血清为一抗,Western blot法鉴定样品中抗原蛋白的含量变化。结果成功表达带有GST标签的NSP1蛋白,并获得相应的兔抗血清,且抗原纯度较高;制备的兔抗血清能正确识别真核表达的NSP1-eGFP融合蛋白,并能鉴定灭活疫苗生产过程中蛋白含量的变化;灭活疫苗成品中不含NSP,疫苗纯度高;E蛋白与其他3种主要结构蛋白M、S、N的表达时相不同,早期表达晚期下降。结论制备的NSP1兔抗血清可用于NSP1和E蛋白功能的研究,以及灭活疫苗生产过程中纯度和质量的监控。

抗柯萨奇病毒A组2型单克隆抗体制备及ELISA抗原检测方法的建立

目的制备抗柯萨奇病毒A组2型(coxsackievirus A2,CV-A2)单克隆抗体(单抗),建立CV-A2抗原检测方法。方法用纯化后的CV-A2全病毒颗粒免疫小鼠,筛选获得抗CV-A2单抗。建立CV-A2抗原检测方法,确定线性范围,对其准确度、精密度、稳定性、专属性进行验证。用ELISA检测病毒颗粒纯化过程中样品的抗原含量。结果制备了高效价的抗CV-A2单抗并建立ELISA抗原检测方法,检测范围为5.00~320.00 ng/ml。高、中、低3个浓度样品准确度验证回收率在89.58%~104.78%之间。重复性验证变异系数分别为2.10%、2.47%、6.18%。中间精密度验证变异系数分别为2.89%、2.69%、1.94%。耐用性验证回收率在84.26%~114.21%之间。包被微孔板于37℃放置3 d,样品回收率在90.31%~103.11%之间。专属性验证结果显示该方法只识别CV-A2抗原,与其他抗原均无交叉反应。结论建立并验证了CV-A2 ELISA抗原检测方法,可应用于病毒纯化过程中样品的抗原检测,还可应用于含CV-A2的手足口病多价疫苗的CV-A2抗原含量检测。