负载桑黄素的碳点紫外光交联壳聚糖水凝胶对大鼠软骨损伤的作用及其机制研究

目的构建负载桑黄素的碳点紫外光交联壳聚糖(ultraviolet-cross-linkable chitosan-carbon dotsmorin,NMCM)水凝胶,通过体内外实验观察其能否修复软骨损伤,并探讨相关机制。方法取壳聚糖联合甲基丙烯酰酐制备紫外光(ultraviolet,UV)交联壳聚糖、联合丙烯酰胺制备碳点,两者混合后加入桑黄素溶液,在UV下照射交联,获得NMCM水凝胶,检测其缓释性能。取关节置换患者自愿捐赠的正常及膝关节骨关节炎(knee osteoarthritis,KOA)软骨组织,分离培养软骨细胞并经甲苯胺蓝染色鉴定。取第3代KOA软骨细胞,首先分别与12.5、25.0、50.0μmol/L桑黄素及负载该浓度桑黄素的NMCM水凝胶混合培养,细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)法检测上述浓度桑黄素及水凝胶对软骨细胞增殖的影响;然后与负载50μmol/L桑黄素的NMCM水凝胶共培养,免疫荧光染色检测Ⅱ型胶原蛋白(collagen typeⅡ,COL-Ⅱ)水平、2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯探针检测活性氧水平。取4周龄SD大鼠20只,构建右后肢膝关节软骨损伤模型,随机分为两组(n=10);其中实验组软骨缺损处注射负载25μmol/L桑黄素的NMCM水凝胶,对照组不作处理。术后4周,取标本micro-CT观察股骨髁软骨缺损修复情况,大体观察缺损部位并行国际软骨修复协会(ICRS)大体评分,番红-O固绿染色及COL-Ⅱ免疫组织化学染色观察软骨和软骨下骨并行ICRS组织学评分,Western blot以及实时荧光定量PCR检测软骨组织中TNF-α、NF-κB、基质金属蛋白酶13(matrix metalloproteinase 13,MMP-13)、COL-Ⅱ蛋白及mRNA表达。结果实验成功构建负载不同浓度桑黄素的NMCM水凝胶,其短时间内药物释放速度较快,24 h后速度逐渐放缓,96 h时释放量接近于0,此时药物累积释放率达88%。浓度≤50μmol/L的桑黄素对软骨细胞无毒性作用,且在NMCM水凝胶干预下,软骨细胞增殖能力提高(P<0.05)。NMCM水凝胶可提高KOA软骨细胞中COL-Ⅱ水平(P<0.05),降低活性氧水平(P<0.05),但尚未达正常水平(P<0.05)。动物实验显示,实验组术后4周关节面粗糙,软骨缺损可见,但其周围有组织修复,关节间隙仍保持正常;对照组关节面更粗糙,软骨缺损未见组织修复。与对照组相比,实验组软骨细胞较多,COL-Ⅱ表达增强,ICRS大体及组织学评分均较高(P<0.05);MMP-13、NF-κB、TNF-α蛋白及mRNA相对表达量降低,COL-Ⅱ蛋白及COL-2a1 mRNA升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论NMCM水凝胶能促进大鼠膝关节软骨细胞增殖、抑制软骨细胞分解代谢,抵抗氧化应激反应,保护软骨细胞,促进软骨修复。

微重力环境下肢体废用性萎缩对于软骨细胞外基质成分和表型分化的作用研究

研究微重力环境下肢体废用性萎缩对于软骨细胞外基质成分及其表型分化的作用,为寻找适当的机械负荷平衡骨关节炎造成的细胞外基质的降解,维持软骨细胞表型提供新思路。方法:使用胰酶及Ⅱ型胶原酶消化提取大鼠膝关节软骨细胞,传代培养至第3代。将细胞分为4组:正常重力软骨细胞组、正常重力关节炎软骨细胞组(关节炎软骨细胞采用10 ng/ml IL-1β诱导48小时造模)、微重力软骨细胞组、微重力关节炎软骨细胞组。微重力环境的2组细胞采用双向多样本回转器(2D-RWVs)培养,正常重力组不施加旋转,培养72小时。期间利用倒置显微镜观察各组软骨细胞的排列和形态差异。培养完成后,使用Western blot法检测各组软骨细胞Ⅱ型胶原、基质金属蛋白酶-13(Matrix metalloproteinase-13,MMP13)的表达。结果:从软骨细胞的形态学来看,正常重力软骨细胞集落样生长,多层重叠,可见典型铺路石样改变。微重力环境下软骨细胞形态不规则,排列紊乱,界限模糊,典型铺路石样表现缺如。Western blot结果显示,无论是正常软骨还是关节炎软骨,MMP-13及II型胶原的相对蛋白水平均为微重力组明显高于正常地面组(P<0.05)。结论:微重力环境能够维持软骨细胞的表型,获得分化良好的软骨细胞。微重力环境在分子层面上调了MMP-13及II型胶原的合成与分泌。