肉食兽细小病毒通用PCR诊断技术的建立

根据肉食兽细小病毒核苷酸序列高度同源的特点 ,设计合成了 1对引物 ,以犬细小病毒、貂肠炎病毒和猫泛白细胞减少症病毒细胞培养物为 DNA模板 ,进行 PCR特异性片段扩增 ,扩增片段大小为 0 .6kb。结果表明 ,扩增产物与设计的 2个引物之间的序列大小一致。通过通用性、特异性与敏感性试验及对临床送检样品检测 ,证明本法对肉食兽细小病毒通用 ,且具有快速、特异和高度敏感的特点。

生长激素转基因家蝇的建立

利用显微注射技术，将人生长激素表达载体导入家蝇受精卵，人工孵化后收集子１、２代卵，提取染色体，经核酸探针及ＰＣＲ特异片段扩增检测，两代均为阳性。对整合阳性卵孵化至幼虫，热冲击诱导后立即进行表达检测，结果发现，人生长激素在蝇幼虫体内实现了表达，表达量最高可达４．０４μｇ／Ｌ。对转基因家蝇不同发育阶段的表型特征进行了观察。

水貂肠道冠状病毒和呼肠病毒的病原性及在腹泻中的作用

1 前言水貂流行性腹泻是继水貂病毒性肠炎(MVE)、阿留申病、犬瘟热之后发现的传染性疾病。1975年首次报道于美国,称之为水貂流行性卡他性胃肠炎(ECG)或犹他州肠炎。我国自1987年起在许多貂场也有本病暴发,给养貂业造成严重的经济损失。1987年韩慧民等人报道在病貂粪便中发现有冠状病毒样粒子,但冠状病毒分离培养困难,因此无法进一步证实其对水貂的致病性。我们在研究过程中,用貂肺传代细胞系(ML)分离获得2株冠状病毒。

非典型肺炎冠状病毒与其他动物冠状病毒的亲缘关系

非典型肺炎即重症急性呼吸综合征 (severe acute respiratory syndromes,SARS) ,其病原目前被普遍认为是一种冠状病毒。本试验利用分子生物学计算机软件 ,首先对已在 Gen Bank中发表的 17株 SARS病毒的主要结构蛋白基因S、M、N进行了定位 ,然后分别与已发表的其他冠状病毒的 S、M、N基因进行同源性分析。结果发现 ,我国内地的 5个SARS毒株的主要结构蛋白基因与其他冠状病毒的相对应基因的同源性普遍较低 ,而且变化范围较大。香港及国外的SARS毒株的情况恰好相反。从总体上看 ,SARS病毒与已发表的其他冠状病毒的亲源关系均较远 ,相对而言 ,与牛冠状病毒 (BCV)、小鼠肝炎冠状病毒 (MHV)的亲缘关系最近。这一结果对于 SARS病毒的起源及流行病学研究乃至该病的预防和控制研究具有一定的参考价值。

家蝇卵黄蛋白基因启动子区的克隆与活性分析

从家蝇基因组文库中分离到含约 1 7kb 5′上游区的家蝇卵黄蛋白 1基因组基因序列 ,根据其 5′上游序列 ,PCR扩增出大小不同的 4个启动子片段 ,分别插入到切除了CMV启动子的 pCMV GFP质粒中的绿色荧光蛋白报告基因上游 ,构建了 pMYP1 GFP、pMYP2 GFP、pMYP3 GFP和 pMYP4 GFP 4个重组质粒。另将 +6 84 /+7、+116 5 /+7这两个启动子片段用SpeⅠ和HindⅢ双酶切 ,去除包含CAAT/TATA盒的 +30 2 /+7序列区后 ,分别构建了pMYP5 GFP和 pMYP6 GFP两个重组质粒。通过电转移实验和荧光检测表明 ,+6 84 /+7、+116 5 /+7、+16 16 /+7这 3个启动子片段具有转录活性 ,而 +6 84 /+7启动子片段的转录活性最强 ,+2 96 /+7、+6 84 /+30 2、+116 5 /+30 2这 3个启动子片段无转录活性。上述实验结果表明 ,+30 2 /+7序列区为启动子的核心部分 ,+30 2到 +16 16之间存在调控性启动子或增强子等其他一些顺式元件。细胞转染实验证实 ,6种启动子片段在BHK-2 1和Sf9细胞中都未表现出可检测的转录活性 ,说明家蝇卵黄蛋白基因启动子具有组织或细胞特异性。

犬腺病毒、犬细小病毒联合PCR方法的建立与应用

根据GenBank报道的犬腺病毒(CAV)和犬细小病毒(CPV)序列,设计两对联合PCR引物,其中一对为CAV-1和CAV-2通用引物,另一对为CPV引物。在建立单项PCR基础上,通过优化Mg2+离子浓度和循环参数等反应条件建立联合PCR,确定联合PCR条件为:96℃180s,96℃30s,56℃30s,72℃80s,30个循环。联合PCR结果显示:CAV-1扩增片段大小为497bp,CAV-2为1019bp,CPV为719bp;细胞和其它相关病毒对照均无扩增带。上述PCR产物经用限制性内切酶酶切和克隆测序,结果均与相应病毒的应有条带和序列相同。敏感性比较试验结果表明,联合PCR比用细胞培养分离病毒敏感。将联合PCR应用于15份CAV和CPV细胞培养物,5份CAV-1、1份CAV-2和3份CPV人工感染犬病料以及30份临床病料检测,并与电镜负染、HA/HI及病毒分离等方法的结果进行比较,结果显示,联合PCR的检出率和病毒分离结果一致,高于电镜负染和HA/HI试验。以上结果说明:CAV-1/CAV-2和CPV联合PCR不仅具有很好的特异性和敏感性,而且可以在短时间内(2 5h～3h)同时鉴定出上述三种病毒,因此具有良好的实验室诊断和临床应用价值。

家蝇基因组文库的构建

从孵化 36 h的蝇蛆中提取基因组 DNA,用限制性内切酶 Bcl 随机酶切 ,回收 10～ 2 3kb的酶切 DNA片段 ,通过匹配粘性末端与磷酸化的 EMBL3Bam H 酶切载体臂连接 ,在体外经包装系统包装成活的重组噬菌体 ,成功地构建了家蝇基因组文库。重组噬菌体转染 KW2 51 宿主菌 ,测定文库效价为 5× 10 4 pfu/m

抗菌肽的特性及其应用前景

抗菌肽的特性及其应用前景李恩民刘维全殷震（中国人民解放军农牧大学军事兽医研究所全军基因工程重点实验室，长春１３００６２）中国图书分类号Ｒ９７８．１抗菌肽（ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌｐｅｐｔｉｄｅｓ，ＡＢＰ）是在诱导条件下，动物免疫防卫系统产生的一类对...

急性心肌梗死经皮冠状动脉介入治疗后无再流现象的防治

急性心肌梗死(AMI)患者急诊经皮冠状动脉介入治疗(PCI)后常伴无再流现象,使住院期间病死率和远期心血管不良事件明显增加。引起心肌无再流的影响因素较多,本文就针对这些因素采取的改善心肌灌注的措施进行综述。

人胰岛素基因杆状病毒表达载体的构建及其在Sf_9细胞中的表达

对人胰岛素基因组基因真核表达载体 ( p CMA/m INS)进行 Xho 酶切 ,回收的含人胰岛素基因组基因的 1 60 8bp片段与线性化的杆状病毒载体 p Fast Bac 进行连接 ,获得重组载体 p Fast/m INS。将该重组载体转化 DH1 0 Bac感受态细菌 ,在体内进行重组 ,并经 2次抗性与蓝白斑筛选 ,得到杆状病毒重组载体 Bacmid/m INS。将该载体转染 Sf9细胞 ,获得了重组杆状病毒 ,经 Tricine-SDS-PAGE和 Western-blotting检测 ,重组杆状病毒在 Sf9细胞中的表达产物是胰岛素原 。

云岭黑山羊BMPR-IB基因部分编码区的克隆及多态性分析

应用RT-PCR方法从云岭黑山羊卵巢组织克隆与产羔性状相关的BMPR-IB基因。结果表明,克隆的BMPR-IB基因扩增片段长467 bp,扩增片段位于该基因编码区第497与963位碱基之间,与已报道的野生型山羊、绵羊、猪、人和鼠的BMPR-IB基因该编码区的同源性分别为99%、99%、92%、92%和87%;与野生型山羊相比,云岭黑山羊BMPR-IB基因第498位和575位碱基存在多态性位点,其中第498位碱基由T突变为C,组成的密码仍编码天冬氨酸(Asp,D),为同义突变;第575位碱基由C突变为T,编码的氨基酸由脯氨酸(Pro,P)变为亮氨酸(Leu,L),为错义突变;BMPR-IB蛋白的二级结构在错义突变位点可能具有多种构象。本研究结果为深入研究BMPR-IB基因与云岭黑山羊产羔性状间的关系奠定了基础。

含第1内含子的猪生长激素cDNA基因的构建

以 PCR方法扩增了猪生长激素 ( p GH)基因的第 1内含子 ,经测序表明 ,扩增的 p GH基因第 1内含子的序列与 Vize发表的序列存在 6个碱基的差异 ,同源性达 97.5%,说明 p GH基因第 1内含子具有多态性。此外 ,还发现此内含子存在有转录因子 ATF的结合位点。利用第 2外显子的 Hinf 位点 ,采用将 3个 DNA片段一步连接的方法 ,将扩增的第 1内含子插入到 p GHc DNA的正确位置上 ,从而构建出含第 1内含子的p GHc DNA。

抗菌肽Shiva-1基因的人工合成与克隆

参照抗菌肽 Shiva-1的氨基酸序列 ,兼顾鱼类、昆虫和大肠杆菌偏爱的密码子 ,设计了 Shiva-1基因序列 ,加上适宜基因工程操作的酶切位点 ,人工合成了 2条分别为 92 bp和 91 bp的寡聚核苷酸片段。经互补链延伸反应、Eco RI酶切 ,将完整的 Shiva-1基因反向克隆至 p UC1 8载体 ,经 PCR检测和序列分析证明 ,已正确克隆了抗菌肽

禽流感与新城疫二联RT-PCR诊断方法的建立及其应用

根据禽流感病毒 (AIV)、新城疫病毒 (NDV)基因组序列高度保守区 ,设计合成了 2对引物 ,以AIV、NDV培养物提取RNA并反转录 ,进行RT PCR特异性片段扩增 ,扩增的片段大小分别为4 70和 32 0bp。结果 ,扩增产物与设计的 2对引物之间的序列大小一致。通过特异性与敏感性试验 ,AIV、NDV培养物均可扩增至 1 0 - 4,表明本方法对 2种病毒具有快速。

抗菌肽的研究进展

抗菌肽又称抗微生物肽(antimicrobial peptide)或肽抗生素(peptide antibiotics),在动植物体内分布广泛,是天然免疫防御系统的一部分。抗菌肽不仅有广谱抗细菌能力,而且对真菌、病毒及癌细胞也有作用。对抗菌肽作用机理的研究是近来的热点之一,本文综述了此方面近来的进展,并对微生物针对抗菌肽的耐药性进行了讨论。

抗菌肽天蚕素B突变体ABP-S1基因在E.coli中的融合表达

利用绿色荧光蛋白 (GFP)基因与天蚕素 B突变体 ABP- S1基因的融合基因 ,构建了 2个原核表达载体 p Am GS1和 p Bm GS1,转化表达宿主菌 E.coli BL 2 1(DE3)和 E.coli BL 2 1(DE3) p L ys S。结果 ,p Am GS1未能得到转化子 ,而p Bm GS1的转化子高效表达了融合蛋白 ,经 IPTG诱导 ,SDS- PAGE检查 ,融合表达产物最高可占菌体总蛋白的49.45 %。表达产物经包涵体复性 ,柱层析初步纯化 ,通过平板抑菌试验 ,对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、变形杆菌以及鱼类重要的致病菌嗜水气单胞菌等多种革兰氏阳性。

小齿短肛棒实验室饲养及断肢再生能力的观察

以榆树叶片为饲料 ,在室温条件下观察了小齿短肛棒 (Baculumminutidentatum)的发育过程及断肢的再生情况 ,并对虫体总RNA的提取方法进行了尝试。结果表明 :在实验条件下 ,小齿短肛棒整个发育期完成蜕皮 5次 ,7月份开始产卵 ,8月中旬成虫陆续死亡。断肢再生现象伴随蜕皮出现 ,是小齿短肛棒的一种极强的生物特性 ,且第 1次至第 3次蜕皮期间的再生现象明显 ,可能是研究断肢再生机制的理想时期。不同个体的再生能力未见明显差异 ,不同足的再生能力也没有显著差别 ,但伴随第 4次和第 5次蜕皮的再生现象较少出现。

视网膜色素上皮细胞光损伤早期基因的差异表达

目的 分离视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞光损伤早期差异表达的基因。方法 对光损伤早期培养的 RPE细胞,应用差异显示(differential display,DD)技术和银染变性 SDS-PAGE分析方法,分离差异表达的基因。结果 获得一段长为458bp新的基因序列,在GenBank登录,登录号为:AF509472。结论 在可见光对培养的RPE细胞损伤的过程中,除一些已知基因的表达外,可能还有新的基因参与了这一过程。

第一内含子对人胰岛素基因在BHK细胞中表达的影响

目的 构建人胰胰岛素基因真核表达载体 ,为胰岛素基因研究奠定基础。方法 从人基因组文库中扩增胰岛素基因的第一内含子 ,经测序证实其序列完全正确后 ,与pCMV mINS中的mINS基因融合 ,构建成带有第一内含子的胰岛素基因组基因真核表达质粒pCMV ImINS。分别用pCMV mINS和pCMV ImINS转染BHK细胞 ,经G4 18筛选 ,将阳性克隆传至 2 0代后 ,用放免方法和免疫组化法分析胰胰岛素和 或胰岛素原在BHK细胞中的表达量情况。结果 经放免测定 ,pCMV mINS和pCMV ImINS在BHK细胞中胰岛素和 或胰岛素原的表达量分别为4 0 77μIU ml和 5 0 6 8μIU ml。经免疫组化分析 ,pCMV mINS在BHK细胞质中胰岛素表达水平的灰度值为 190 0±19 5 6 ;pCMV ImINS在BHK细胞质中胰岛素表达水平的灰度值为 186 4± 10 2 4。

启动子CMV和EF1α对人胰岛素基因在BHK细胞中表达的影响

目的 构建人胰岛素基因真核高效表达载体 ,为胰岛素转基因研究奠定基础。方法 用限制性内切酶SpeⅠ和HindⅢ消化pEF1α GFP ,回收 1 2kbEF1α启动子 ,插入到pCMV mINS的NruⅠ和HindⅢ位点中 ,获得重组质粒pEF1α mINS ;将pCMV mINS和pEF1α mINS分别转染BHK细胞 ,用G418筛选 ,阳性克隆传至 2 0代后 ,分别用放免方法和免疫组化法分析胰岛素和 或胰岛素原在BHK细胞中的表达情况。结果 经放免测定 ,pCMV mINS和pEF1α mINS在BHK细胞中胰岛素和 或胰岛素原的表达量分别为 4 0 77μIU ml和 6 897μIU ml。经免疫组化分析 ,pCMV mINS在BHK细胞质中胰岛素表达水平的灰度值为 190 0± 19 5 6 ;pEF1α mINS在BHK细胞质中胰岛素表达水平的灰度值为 181 4± 18 45 ,在BHK细胞核中表达水平的灰度值为 15 5 4± 11 6 6。结论 在BHK细胞中启动子EF1α启动胰岛素基因表达的活性比启动子CMV高。