枯草芽孢杆菌壳聚糖酶在毕赤酵母中的高效表达及其酶解特性

研究枯草芽孢杆菌壳聚糖酶基因(Bs Csn46)在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中的高效表达、重组酶性质及其酶解特性。重组菌在5 L发酵罐高密度发酵后胞外酶活力高达50 370 U/mL,蛋白质量浓度15.7 mg/mL。粗酶经强阴离子交换层析纯化,纯酶比活力为4 065.7 U/mg,最适pH 6.0,最适温度55℃,在45℃以下保持稳定。该酶水解3 g/100 mL壳聚糖得到主产物为二糖、三糖和四糖的壳寡糖,水解率为92.8%,壳寡糖得率为90.9%。本研究的重组壳聚糖酶产酶水平和水解效率高,为工业化制备壳聚糖酶及大规模制备壳寡糖的应用提供了理论支持。

海南粗榧内生真菌对罗非鱼无乳链球菌抑菌活性研究

利用活菌菌饼法和滤纸片法研究筛选64株海南粗榧内生真菌对罗非鱼源无乳链球菌的抑菌活性,并对活性菌株的代谢产物化学成分进行初步测试。菌饼试验结果显示,11株海南粗榧内生真菌对无乳链球菌具有明显抑制作用,占总菌株数的17.2%,抑菌圈在Φ（8.7±0.3~16.2±0.2）mm间。滤纸片试验结果显示,12株具有明显抑制作用,占总菌数的18.8%,抑菌圈在Φ（8.7±0.3~28.2±0.4）mm间。2种方法的最高活性菌株不一致,但最高活性菌株（B30、F52）和同时显示较高活性的菌株（B14、B30、B32、F7、F52）被测出都含有甾体及三萜类化合物。根据结果推测,对无乳链球菌有显著抑制作用的菌株可能含有甾体及三萜类物质。结果为深入研究内生真菌对罗非鱼无乳链球菌的抑制奠定基础,也为生物防治罗非鱼病害提供有益借鉴。

不同发酵方式对海南粗榧内生真菌CH1307c合成次级代谢产物的影响

为研究不同发酵方式对内生真菌次级代谢产物产量、成分类别及其对3种常见白血病细胞株的细胞毒活性影响。分别采用大米固态发酵、麦麸固态发酵、马铃薯液态静置发酵、马铃薯动态发酵4种发酵方式对分离自海南粗榧韧皮部内生真菌CH1307c进行发酵,并采用乙酸乙酯进行萃取,通过试管定性试验和MTT试验测定其粗提物的成分类别及其对细胞株K562、NB4、HL60的细胞毒活性。结果表明:大米固态发酵、麦麸固态发酵的次级代谢粗提物产量相对于马铃薯动态发酵分别增加了45.9倍和28倍;马铃薯动态发酵较其静置发酵产量高9.1倍。试管定性试验结果表明,大米固态发酵获得的粗提物,化合物种类最多,麦麸发酵和动态发酵次之,马铃薯液态静置发酵最少。此外,4种发酵方式获得的代谢粗提物对3株细胞株的抗肿瘤活性(IC50值)并未呈现明显差异。研究结果为该菌株的大规模发酵提供理论依据。

海南粗榧内生真菌A29代谢产物抑菌活性的研究

利用滤纸片法以枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌以及三株植物病原菌水稻纹枯病菌、香蕉枯萎病菌和油菜菌核病菌作为测试菌,对海南粗榧内生真菌A29在不同生长周期16d的次级代谢产物的抑菌活性进行测试。然后,对其最佳发酵周期的代谢产物化学成分进行初步测定,最后利用HPLC-MS分析其次级代谢产物的结构。结果显示,12d为内生真菌A29的最佳发酵周期,A29代谢产物包括生物碱类、酚类、蒽醌类、有机酸类、甾体及三萜类、皂苷类化合物,在匹配度较高的化合物中,被报道具有较强抑菌活性的化合物包括次黄嘌呤(Hypoxanthine)、布雷菲德菌素A(Decumbesterone A)、降香真双素(Acrovestone)和托可皂苷(Tokoronin)。根据结果推测,海南粗榧内生真菌A29的次级代谢产物具有较强的抑菌活性可能与以上4种物质有关。结果为后继的发酵,分离纯化其抑菌活性代谢产物奠定基础。

长双歧杆菌α-唾液酸苷酶在大肠杆菌中的表达及酶学性质

[背景]唾液酸苷酶是一类水解唾液酸糖复合物末端唾液酸残基的糖苷水解酶,广泛存在于动物和微生物中,具有重要的生物学功能。[目的]克隆一个长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)唾液酸苷酶基因(blsia42)并在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达,探讨该重组酶的酶学性质。[方法]从长双歧杆菌中克隆唾液酸苷酶基因(blsia42),构建重组表达质粒pET-28a-blsia42并在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达。BlSia42粗酶液经Ni-NTA亲和层析纯化后研究其酶学性质。[结果]BlSia42纯酶的比酶活为164935.2 U/mg。SDS-PAGE法和凝胶过滤法测定BlSia42的分子量分别为42.8 kDa和41.5 kDa。该酶的最适pH和温度分别为6.0和50℃,在pH 3.5-9.0和45℃以下稳定。BlSia42底物特异性广泛,对α2,3、α2,6和α2,8糖苷键均显示出水解活性,对3’-唾液酸乳糖和多聚唾液酸的水解活性分别为6’-唾液酸乳糖水解活性的87.50%和67.19%。BlSia42水解多聚唾液酸12 h后,唾液酸浓度为2.4 g/L,水解率为23.6%。[结论]唾液酸苷酶BlSia42优良的酶学特性使其在唾液酸及其衍生物的制备中具有潜在的应用价值。