油菜对毒素草酸的吸收代谢与抗性机理

放射自显影实验发现１４Ｃ－放射性物质在抗、感菌核病油菜品种中的分布不同，抗病品种表现限制放射性物质转运。油菜叶对所吸收草酸的转化率在５７％以上，而且抗病品种大于感病品种。在放射性物质中未转化的可溶性草酸盐仅占１．２％，而不溶性的草酸盐占２８％以上。在草酸转化物糖、有机酸和氨基酸中糖所占比例最大。草酸诱导油菜苗过氧化物酶活性增加，其增加幅度是抗病品种大于感病品种。草酸抑制多酚氧化酶的活性。发现草酸在较高浓度下也抑制苯丙氨酸解氨酶活性。

油菜防卫素和草酸氧化酶基因的克隆与诱导表达水平研究

基于拟南芥、甘蓝及油菜等的植物防卫素(PDF)相关基因序列和已克隆的油菜草酸氧化酶(OXO)基因序列设计PCR引物,对甘蓝型油菜基因组DNA进行扩增,获得了序列大小分别为470bp和629bp的PDF1.2和OXO。生物信息学分析表明,该PDF1.2和GenBank中的相关基因同源性在42%～71%,OXO和GenBank中的相关基因同源性在70%以上。在油菜苗期,油菜黑胫病病原接种后基因PDF1.2表达量增加3倍以上,基因OXO也有不同程度的增强表达;诱导剂acibenzolar-s-methyl诱导基因OXO增强表达,但不能诱导PDF1.2增强表达。诱导的系统表达(非处理叶)高于局部表达(处理叶)。这是首次报道油菜PDF1.2克隆和诱导表达结果。

甘蓝型油菜抗菌核病扩展的遗传分析

以核盘菌菌丝体接种 11个油菜品种 (系 )的离体叶片 ,结果表明不同品种间病斑大小差异显著 ,病斑随接种后时间延长呈逻辑斯蒂曲线增长 ,抗、感品种之间抗病斑扩展的差异显著。条件方差分析表明 ,草酸浸根处理第 3d到第 4d ,油菜抗毒素的条件广义遗传力达 0 .784;草酸浸叶柄处理第 3d到第 4d ,加性方差占总方差 2 3.1% ,处理第 4d到第 5d加性方差下降为 0 ,表明条件加性效应值和条件显性效应值在不同的时段是不同的。

菌核菌生长和产生草酸的营养和环境条件研究

本研究探讨了培养基种类、酸碱度、温度对菌核菌(Sclerotinia sclerotiorum)菌丝生长(MG)和草酸累积(OA)的影响及MG和OA之间的动态变化过程。正交试验中,碳源为:琥珀酸钠-葡萄糖、蔗糖-马铃薯汁液和蔗糖的三种培养基中,OA量依次递减且差异显著。MG和OA成负相关关系。培养基的pH值是影响OA的一个主要因子,本试验中pH6最适合菌丝产草酸,而pH5最适合菌丝生长。23℃下OA和MG大于26℃下OA和MG。OA和MG的动态变化过程试验表明,不同培养基的草酸累积速率和最终量差异显著。本文认为碳源种类或草酸前体物是影响OA的主要因子。

抗感菌核病油菜品种对草酸的吸收和转运差异

研究了菌核病抗性不同的油菜品种对草酸的吸收和转运差异。经预处理后的3～4叶期油菜苗的根放进14C—草酸钾浓液（pH5）中，在20±0．2℃，6000Lux下处理4h。草酸钾浓度和放射性比度分别为5mmol／L和5μCi／ml。放射自显影和放射性强度测定结果表明：油菜对草酸有明显的吸收作用，高抗品种，如中R－888其放射性物质主要分布在叶脉中，表现为限制放射性物质的转运；感病品种，如84039放射性物质在叶片中分布较均匀。高感品种吸收的放射性物质是高抗品种的4倍以上，低抗和低感品种介于高抗和高感品种之间。

油菜根肿病病原主要生理小种和品种抗病性鉴定

采用Williams法对采自国内油菜主产区的19个油菜根肿病菌进行生理小种鉴定。结果表明,我国甘蓝型油菜根肿病病原至少存在2号、4号和13号等3个生理小种类型,其中4号小种存在的范围最广泛。湖北省枝江市、当阳市,安徽省黄山市歙县,云南省玉溪等4县(市),四川省绵阳等5县(市)共16个采样点的根肿病病原为4号生理小种;安徽省黄山市休宁县齐云山镇2个采集地点为13号生理小种;仅安徽省黄山市休宁县商山镇的病原为2号生理小种。分别在枝江、黄山根肿病重发病区对52个油菜品种进行抗性研究,结果表明,赣两优三号、蓉油9号、浙双6号、华油杂12号、中油5628、扬油8号、宁油12号、浙油28、中双10号、沣油520等10个油菜品种在枝江对4号生理小种表现抗病;成油杂6号、德68-12、滁杂优3号3个杂交种在黄山对13号生理小种表现出抗病。它们可作为当地根肿病病区主栽品种及育种材料使用。

油菜不同器官高质量总蛋白提取方法和双向电泳体系的优化

以显性核不育油菜Shaan—GMS不育株和可育株的花序和叶片为材料，采用TCA（三氯醋酸）-丙酮法提取油菜花蕾、花药及叶片总蛋白，对总蛋白提取方法、IPG（固定pH梯度）胶条种类、聚焦程序、凝胶浓度、上样量等环节进行了优化。结果表明，采用理想的蛋白质裂解液（7mol／L尿素，2mol／L硫脲，4％CHAPS（3-[3-（胆酰氨丙基）二甲氨基]丙磺酸内盐），65mmol二硫苏糖醇，0．5％IPG缓冲液pH3～10或pH4～7，全蛋白酶抑制片剂（片／10mL））裂解蛋白，以150μg上样，按IEF程序Ⅱ（30V，12h；200V，1h；500V，1h；1000V，0．5h；10000V，2h；10000V，8h）进行等电聚焦，10％SDS—PAGE胶浓度进行第二向电泳，银染方法检测，可得到背景清晰、分辨率较高的油菜花蕾、花药及叶片蛋白质电泳图谱。高质量油菜蛋白的提取方法和蛋白质分离双向电泳体系的优化可为油菜蛋白质组学研究奠定技术基础。

油菜基因BnWRI1的克隆及RNAi对种子含油量的影响

【目的】阐明油菜基因BnWRI1对其种子含油量的影响。【方法】采用RT-PCR技术从油菜中克隆到BnWRI1基因编码区内384bp的片段,将该片段正反向插入干扰载体pGΩ4ARi中,构建成RNAi表达载体pGΩ4ARi-WRI1,通过花粉管通道法将其转入油菜受体品种中双9号中,【结果】获得3棵转基因植株,PCR扩增和基因组Southern杂交证实外源片段已整合在受体油菜基因组中。利用半定量RT-PCR和改进的索氏提取法分别检测转基因T1代植株的BnWRI1基因表达量和种子含油量,结果表明:与非转基因对照相比,转基因植株的BnWRI1基因均受抑制,种子含油量有所降低。【结论】采用RNAi技术可使油菜内源基因BnWRI1沉默,表明油菜基因BnWRI1能有效调控种子含油量。

一种适用于油菜、大豆、花生、芝麻四种油料作物种子的RNA提取方法

油料作物种子中,大量油脂、蛋白、酚类物质的存在和易氧化的特点导致RNA提取困难。为了解决这一问题,本研究在商业化RNA提取试剂盒的基础上,通过以下3方面的改进,使之成功应用于油菜、花生、芝麻和大豆的各个时期种子RNA提取和后期的荧光定量分析实验:1)增加抗氧化剂巯基乙醇和PVP;2)根据不同作物的油脂含量调整氯仿的比例;3)改进RNA沉淀方法,加大洗脱液体积后用乙醇沉淀。与常规的CTAB、TRIZOL及文献报道的RNA提取方法比较,本方法提取的RNA更完整、得率更高、纯度更高;所得RNA被成功应用于FAD2基因的荧光定量表达分析,发现了四种作物种子不同发育时期的FAD2基因的表达差异,证明了改良方法的有效性。

甲基茉莉酸、苯丙噻重氮、草酸诱导油菜对菌核病的抗性

采用温室盆栽方法研究甲基荣莉酸（MeJA）、苯丙噻重氮（BTH）和草酸（OA）诱导油菜对菌核病产生的局部和系统抗性。结果表明，0．01-1．0mmol/LBTH，0．1-1．0mmoL／L MeJA和0．5—15mmol／LOA均能有效诱导局部和系统抗性，系统抗性比局部抗性产生晚。Trypan blue染色结果表明，在MeJA，BTH和低浓度OA诱导过的油菜叶片中．菌丝生长受到抑制，表现为菌丝变粗、弯曲。较低浓度（如0．01mmol／LMeJA，0．5mmol／LOA）下虽然易诱导局部抗性，而系统抗性较弱，0．01mmol／LMeJA几乎不诱导系统抗性。高浓度（如20mmol／L以上）OA有致病作用。

甘蓝型油菜核不育材料Shaan-GMS不育基因的RAPD标记

以825条10碱基随机引物对甘蓝型油菜Shaan-GMS转育的杂合近等基因系220AB的可育群体和不育群体进行PCR扩增,其中632条引物共扩增出2043条带,引物BA1102在220AB的可育群体及不育群体间扩增出2条多态性条带,BA1102.500只在220AB的不育群体中出现,BA1102.1000在220AB的不育群体中缺失。进一步对单株PCR分析表明,15株不育株都扩增出了BA1102,500条带;未扩增出BA1102.1000条带,而15株可育株的扩增结果相反,说明BA1102.500是与Shaan-GMS的显性核不育基因Ms相连锁的阳性带。在恢保关系相同的双显性核不育材料6CA的F_1可育和不育群体中,BA1102未获得多态性。

利用高密度SNP标记定位甘蓝型油菜株高QTL

为了提高甘蓝型油菜株高的分子标记辅助育种效率,以888-5（矮秆）×M083（高秆）构建的重组自交系为材料,通过利用新开发的油菜60K SNP芯片对群体进行SNP标记分型,并结合单环境和多环境2种QTL检测方法对4个环境下株高进行了QTL定位及其与环境互作分析。结果表明：2种QTL定位方法,共检测出27个油菜株高QTL,分布于8个连锁群（A2、A4、A5、A6、A9、A10、C3和C7）,单个QTL可解释的表型变异为0.70%~26.10%。其中6个QTL与环境存在互作效应,在4个环境下效应大小不一,但效应方向表现一致。主效QTL q PH2-4在2个环境下重复检测到,对表型变异解释为17.96%~26.10%,而且有2个SNP标记距离该QTL的最大峰值小于0.2c M。这些QTL为油菜株高的遗传改良提供了有用的遗传信息。

四种油料作物中的细菌型PEPC基因的鉴定及在发育种子中的表达

鉴定和获取了四种油料作物(油菜、大豆、花生和芝麻)中的细菌型PEPC基因,分析了所编码蛋白的保守结构域(BOX I-IV)和蛋白作用功能位点。基因包括甘蓝型油菜的Bna10093361、Bna1009749和Bna10093360,大豆的Glyma10g34970.1,Glyma01g22840.1和Glyma02g14500.1,芝麻的SIN1018296和花生的AhPPC5。这8个基因通常含有19～21个内含子,内部插入一个约350～600bp的高度变异区,编码的蛋白在C端形成R/KNTG结构域,在N端缺乏磷酸化作用位点。在种子发育的不同时期,油菜中仅Bna10093360表达,但其表达量不到油菜Bn-Actin表达量的0.1%;大豆中Glyma10g34970.1表达量最高(接近大豆GlymaActin的2%),Glyma02g14500.1次之;花生AhPPC5表达量为花生AhActin的32%～175%,在种子不同发育时期表达量为早期>中期>晚期;芝麻SIN1018296表达量为芝麻SINActin的3%～18%,在种子发育时期的表达趋势和花生AhPPC5相似。8个基因种子中的表达模式差异明显,说明细菌型PEPC基因可能存在着广泛的功能分化。

枯草芽胞杆菌在油菜根茎叶的定殖动态和生防作用研究

采用常规方法跟踪枯草芽胞杆菌Tu-100在缩影系统油菜根际的定殖情况。Tu-100在油菜不同根段部位的定殖密度从上到下呈现了逐渐递减的规律。随着接种后时间的延长而逐渐下降。在根段8 cm以外的根区几乎检测不到接种菌。在油菜播种后3d,定殖密度可达最高水平(8.3×105个/g),然后急速下降,30d后保持相对稳定的较低水平(1.3×102个/g)。在油菜三片真叶时喷雾接种一次,20d后,在茎和叶上不能检测到所接种的Tu-100,并且抗菌核病的能力也逐渐减弱。

巨大芽孢杆菌A6对油菜根系分泌物所含有机酸和糖类的趋化性

用溶液培养方法采集油菜根系分泌物并研究巨大芽孢杆菌A6对分泌物的趋化性。经高效液相色谱测定,发现油菜根系分泌物中含有7种有机酸和10种糖类。有机酸中琥珀酸含量最高达31.4μg/株;糖类中甘露醇含量最高达7.2μg/株。使用烧杯法和平板趋化法分别测定A6对7种有机酸、10种糖类和油菜根系的趋化性。结果表明,A6对6种有机酸有趋化性,其中对苹果酸的趋化性最强;对8种糖类也有趋化性,其中对山梨醇的趋化性最强;A6对油菜根系也有趋化性。

抗、感菌核病油菜品种几种酶活性对草酸处理的响应

以抗病油菜品种７８３和感病品种８４０３９为材料，４叶期进行１０ｍｍｏｌ／Ｌ草酸浸根处理不同时间后，对其３种酶活性进行测定。结果表明，抗病品种７８３的过氧化物酶（ＰＯＤ）、多酚氧化酶（ＰＰＯ）和超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）活性高于感病品种８４０３９。２个品种叶片中ＰＯＤ、ＳＯＤ的活性都比各自的清水对照高，且抗病品种增加幅度大于感病品种，而ＰＰＯ活性却下降。说明这３种酶在油菜对核盘菌草酸毒素的抗性表达过程中有重要生理生化作用，在抗病育种中可能作为生理指标加以利用。

芝麻抗茎点枯病及枯萎病种质的评价

1997～ 1998年 ,对“八五”期间收集的芝麻种质资源初鉴获得的高抗茎点枯病和高抗枯萎病种质共85份及 4个育种单位提供的 8个新品系 ,在芝麻主产区三个生态试验点 (病圃 )进行了鉴定评价 ,均与当地优良品种进行比较 ,评价出抗性稳定、相对病情指数 <15 %的抗茎点枯病种质 34份、抗枯萎病种质 38份 ,其中兼抗两种病害的 2 7份 ,并明确了不同基因型抗源在不同生态系统中的抗性表现及利用价值 ,对抗、感品种酯酶同工酶分析表明 ,在A区检测出感病品种的相似性和抗。

枯草芽孢杆菌Tu-100对油菜根系分泌物所含氨基酸的趋化性研究

应用水培的方法采集油菜根系分泌物;采用高效液相色谱测定出油菜根系分泌物中所含的16种氨基酸;使用烧杯法和平板趋化法进行趋化性试验,分别测定枯草芽孢杆菌Tu-100对16种氨基酸、油菜根系和油菜菌核的趋化性。结果表明Tu-100仅对组氨酸、脯氨酸、精氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸等5种氨基酸有趋化性,其中组氨酸的趋化性最强;Tu-100对油菜根系和油菜菌核也有趋化性,对油菜根系的趋化性要大于油菜菌核。