杜氏盐藻新型遗传转化方法的建立(英文)

本研究采用LiAc/PEG介导法首次成功地将外源基因导入盐藻细胞,组织化学染色发现转基因盐藻为蓝色,表明外源的基因在盐藻细胞中得到了成功表达。同时还进行了生长状态、转化温度、质粒浓度等因素对转化率影响的研究,优化了转化条件。结果表明,盐藻处于对数生长早期、质粒DNA浓度为600μg/ml、转化温度29℃是最理想的转化条件,其转化率为74.8‰。PCR扩增和PCR-Southern杂交结果证明,目的基因已整合到基因组中,且能够遗传。

杜氏盐藻MAPKK激酶基因DsMAPKKK的克隆、原核表达与纯化

为了进一步研究MAPKK激酶的生理功能,利用RT-PCR技术扩增了Ds MAPKKK的开放阅读框序列,并利用T4连接酶与质粒p GS21a连接,构建了原核表达载体p GS21a-Ds MAPKKK。将该重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导成功表达了融合蛋白。经SDS-PAGE检测,融合蛋白在上清和包涵体中均存在。可溶性蛋白经过GST柱纯化,电泳分析结果表明,在68 k D左右有单一的蛋白条带,说明融合蛋白得到有效纯化。蛋白印迹结果显示在68 k D左右有明显的杂交条带,初步证明纯化的蛋白就是带有GST标签的MAPKK激酶。Ds MAPKKK的成功表达与纯化,为深入探讨Ds MAPKK激酶的性质及功能打下了坚实的基础。

杜氏盐藻磷脂酶C基因DsPLC的原核表达与纯化

为了进一步研究磷脂酶C的生理功能,利用RT-PCR技术扩增了Ds PLC的开放阅读框序列,并与质粒p GS21a连接,构建了原核表达载体p GS21a-Ds PLC。将该重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导表达出融合蛋白。经SDS-PAGE检测,融合蛋白在包涵体和上清中均存在。可溶性蛋白经His柱纯化后进行电泳分析,结果表明,在96k Da左右有单一的蛋白条带,说明融合蛋白得到有效纯化。蛋白印迹结果显示在96kDa左右有明显的杂交条带,初步证明纯化的蛋白是带有His标签的磷脂酶C。盐藻磷脂酶C的成功表达与纯化,为深入探讨磷脂酶C的性质及功能奠定了基础。

杜氏盐藻耐盐分子机制的研究进展（英文）

盐藻是已知最为耐盐的真核生物之一,是研究植物高盐适应的最理想的模式生物。近年来,随着分子生物学技术的发展,盐藻耐盐分子机制的研究也备受国内外学者的瞩目。本文就盐藻适应高盐环境的渗透调节、盐藻耐盐相关基因和蛋白质以及盐胁迫信号转导途径等方面的研究做一简要的综述。

杜氏盐藻促有丝分裂活化蛋白激酶DsMAPK的原核表达及纯化（英文）

盐藻是研究植物耐盐机制的重要模式生物,而MAPK基因在植物耐盐分子途径中起重要作用。该试验通过PCR扩增Ds MAPK基因的开放阅读框(ORF),并将其克隆至带有GST标签的原核表达载体p GS-21a,得到重组表达载体p GS-21a-MAPK。将重组表达载体转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,然后对融合蛋白进行表达形式分析,利用GSTSefinoseTMKit进行纯化,所得产物进行SDSPAGE和Western blot鉴定。结果表明,该试验成功构建了重组表达载体p GS-21a-MAPK,经IPTG诱导后表达的融合蛋白与预期相符,纯化后的上清蛋白经Western blot检测显示该融合蛋白能与抗GST单克隆抗体特异性结合,具有良好的免疫学活性,Ds MAPK的成功表达为进一步在蛋白质水平上研究其在盐藻耐盐机制中的作用奠定了基础。

小分子化合物对间充质干细胞复制性衰老的逆转作用

目的构建基于小分子化合物的全化学培养体系,探讨其在间充质干细胞(MSCs)复制性衰老过程中的作用。方法年轻MSCs连续传至20代(P20),建立复制性衰老细胞模型(P20-MSCs),将P20-MSCs分为衰老模型组与小分子处理组,取第5代脐带MSCs(P5-MSCs)作为对照组。衰老模型组与对照组于全化学培养体系中培养,小分子处理组于含丙戊酸、Repsox的全化学培养体系中培养,均培养7 d。采用β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色检测细胞衰老程度;免疫荧光染色观察细胞中Ki-67、OCT4、Nanog、P16、P21蛋白的表达情况;RT-qPCR检测OCT4、Nanog、P16、P21 mRNA的相对表达量;采用流式细胞术检测细胞凋亡情况;采用划痕实验、Transwell侵袭实验和克隆形成实验检测小分子化合物对衰老MSCs迁移、侵袭和克隆形成能力的影响。结果光学显微镜下观察显示,衰老MSCs体积增大,胞质呈现凸起增多现象。小分子全化学培养体系孵育后细胞恢复为梭形或不规则三角形,与年轻MSCs相似。SA-β-gal染色结果显示,与衰老模型组相比,经小分子处理后细胞SA-β-gal染色阳性率降低,差异有统计学意义(45.00%±1.23% vs.84.80%±1.50%,P<0.001)。免疫荧光染色显示,与衰老模型组相比,小分子处理组中Ki-67、OCT4、Nanog阳性细胞百分比增高(Ki-67:89.00%±1.50% vs.25.00%±2.00%,P<0.001;OCT4:88.40%±0.80% vs.25.40%±1.20%,P<0.001;Nanog:76.30%±1.70% vs.10.50%±0.60%,P<0.001),P16、P21阳性细胞百分比降低(P16:64.00%±3.20% vs.98.00%±1.50%,P<0.05;P21:45.00%±1.10% vs.82.00%±2.00%,P<0.05)。RT-qPCR检测结果显示,与衰老模型组相比,小分子化合物可上调OCT4、Nanog mRNA在老化MSCs中的表达(P<0.001),下调P16、P21 mRNA在老化MSCs中的表达(P<0.05)。与衰老模型组相比,小分子处理组细胞的抗凋亡能力(21.60%±1.20% vs.31.40%±0.80%)、迁移能力(49.30%±3.30% vs.30.60%±4.40%)、侵袭能力[(90.00±12.00)个 vs.(34.00±9.00)个]和克隆形成能力[(144.00±10.00)个 vs.(68.00±7.00)个]均明显提升,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论构建的小分子全化学培养体系能够抑制并部分逆转体外长期培养的MSCs的衰老进程。

巨噬细胞表型在鼠疫杆菌和牛布鲁氏杆菌联合免疫效果早期评价中的潜在作用

目的在需要多种疫苗同时免疫的应急情况下,如何快速评价联合免疫的效果是目前迫切需要解决的问题。本研究旨在探究巨噬细胞表型变化在早期快速评价鼠疫杆菌和布氏杆菌联合免疫效果中的潜在作用及其可能的应用价值。方法建立鼠疫杆菌、牛布鲁氏杆菌疫苗小鼠免疫模型,分别在免疫早期(4 d)和免疫后期(14 d)检测巨噬细胞表型(M1或M2极化)差异,及CD8+T细胞表型功能的变化,分析早期巨噬细胞免疫表型对后期CD8+T细胞功能的影响。结果在联合免疫早期,鼠疫杆菌及牛布鲁氏杆菌同时免疫情况下巨噬细胞M1方向的极化减弱(包括细胞表面CD16/32表达降低及Detectin-1表达升高,细胞内IL-12表达降低及IL-4表达升高),提示疫苗间的相互干扰。同时,两菌联合接种组CD8+T细胞的活性(包括CD8+CD69+T、CD8+INF-γ+T以及CD8+Granzyme B+T细胞的比例)也减弱,出现与巨噬细胞表型一致的变化趋势。结论联合免疫早期巨噬细胞表型与后期反映抗感染免疫应答能力的CD8+T细胞表型及功能出现一致性变化,提示巨噬细胞表型变化有可能应用于早期快速评价联合免疫的效果。

浅析应用区域活动促进幼儿自主发展的策略

材料直接影响着整个活动进行的具体状况,但是,相关的材料价值也不应该仅仅由价格而确定,它应是一种能够促使幼儿发展,激发幼儿兴趣的开放性材料。随着教育改革的不断深化,幼儿自主发展越发重要,因此,对于应用区域活动促进幼儿自主发展的策略研究有着鲜明现实意义。区域活动是幼儿园课程的重要组成部分,也是一种有效的教育方式,是落实幼儿在游戏活动中成长的重要途径。作为幼儿教师,其职责是为幼儿创设一个适宜的活动环境,来支持幼儿的活动。本文立足于幼儿教育教学角度,分析了应用区域活动促进幼儿自主发展的策略,希望具有一定参考价值。

Tim-3对神经小胶质细胞极化的调控作用及机制研究

目的探究T细胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域分子-3(Tim-3)对小胶质细胞极化的调控作用及机制。方法借助流式细胞术检测神经小胶质细胞BV-2上Tim-3及其配体的表达情况;利用ELISA、实时定量PCR方法检测阻断Tim-3功能对BV-2细胞因子表达的影响,进而明确Tim-3对小胶质细胞M1/M2极化的调控作用;通过Western印迹阐明Tim-3调控小胶质细胞极化的分子机制。结果 Tim-3及其配体分子半乳糖凝集素-9(Gal-9)表达于BV-2细胞;阻断Tim-3信号显著增强了BV-2细胞M1极化相关的促炎性细胞因子,包括白细胞介素6(IL-6)、IL-1β、IL-12、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达,抑制了M2极化抗炎性细胞因子,如转化生长因子β(TGF-β)和IL-10的表达,提示Tim-3参与了小胶质细胞极化的调控。同时,分子机制研究发现,Tim-3可能通过抑制小胶质细胞中视黄酸诱导基因蛋白Ⅰ(RIG-Ⅰ)和核因子κB (NF-κB)的表达及活化发挥极化调控功能。结论免疫检查点分子Tim-3参与了BV-2细胞的极化调控。该发现为通过Tim-3探索脑损伤及脑功能障碍性疾病的治疗策略提供了新的实验依据。

故事教学在幼儿园教学中的意义及实践

当前,伴随社会经济的向前推进,中国已经开始了对教育领域的改革,在一些方面也取得了较好的成效,但是仍存在许多传统教育模式的弊端,这就需要相关部门高度关注和重视。特别对于幼儿园小朋友的教学,他们是接触知识的最初阶段,应当为他们提供最优质的学习资料,帮助他们更好的吸收知识。故事教学法同以往教学模式不同,可以让小朋友们边听故事边学习,因此,本文将对幼儿园开展故事教学法教学进行探讨与分析。

Tim-1抗体在防治埃博拉及马尔堡病毒感染中的作用研究

目的利用假病毒方法评价T细胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域分子1 (Tim-1)抗体在防治埃博拉病毒(EBOV)和马尔堡病毒(MARV)感染中的可能作用。方法通过转染EBOV及MARV糖蛋白质粒,制备埃博拉及马尔堡假病毒,以HEK-293T细胞为靶细胞,利用假病毒评价抗人Tim-1(h Tim-1)抗体对EBOV及MARV的防治作用。结果成功制备了能感染HEK-293T细胞的埃博拉、马尔堡假病毒,发现Tim-1在HEK-293T细胞上的表达水平影响假病毒感染效率。同时,成功表达了抗h Tim-1抗体,ELISA及FACS实验证实了其结合特异性,发现制备的Tim-1抗体能中和埃博拉、马尔堡假病毒的感染,并显示出与埃博拉及马尔堡假病毒抗体的协同作用。结论制备的Tim-1抗体显示了良好的中和活性,为埃博拉、马尔堡假病毒感染的防治提供了新的手段,认为假病毒是可行的抗体功能评价方法。

Tim-3对巨噬细胞葡萄糖转运体1表达的调节机制研究

目的探讨T细胞免疫球蛋白及黏蛋白结构域分子-3(T cell immunoglobulin and mucin-domain containing molecule-3,Tim-3)对巨噬细胞葡萄糖转运体1(glucose transporter 1,GLUT1)的表达及其对细胞功能的影响,并初步探索其影响机制。方法使用Tim-3 siRNA敲低Raw264. 7细胞系观察GLUT1蛋白的表达,随后使用不同浓度Tim-3融合蛋白、Tim-3激动抗体,阻断和激活小鼠源巨噬细胞系Raw264. 7,在基因和蛋白水平观察GLUT1、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、Tim-3以及肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α) 4项指标的变化。结果 Tim-3敲低的Raw264. 7细胞系GLUT1蛋白表达水平明显升高;激活、抑制巨噬细胞Tim-3信号能分别抑制和促进GLUT1、TNF-α的基因和蛋白表达以及GAPDH基因表达,但Tim-3的基因和蛋白水平以及GAPDH蛋白水平并无显著变化。结论 Tim-3负调控巨噬细胞GLUT1表达,进一步影响TNF-α分泌,参与TNF-α转录后调控的GAPDH可能参与其中的调节机制。