绵羊lncRNA-MRLN基因的克隆和蛋白编码能力分析

为了验证长链非编码MRLN基因具有蛋白编码能力,通过提取哈萨克羊胚胎期比目鱼肌总RNA,用RT-PCR获得lncRNA-MRLN基因;用EGFP自身发光及不影响目的蛋白特性的特点,构建了pcD-MRLN-EGFP融合表达载体,且转染293T细胞对lncRNA-MRLN是否具有蛋白编码能力进行分析。结果表明,重组质粒经HindⅢ和EcoRⅠ双酶切成1 059bp和5 428bp片段,真核表达载体pcDNA 3.1(+)中插入MRLN和EGFP基因,经测序编码框正确;转染293T细胞后,在荧光显微镜下可以观察到绿色荧光,且通过RT-PCR在RNA水平上可检测到lncRNA-MRLN的表达,说明lncRNA可以编码蛋白。

易变链霉菌TRM 45540四氢嘧啶合成相关基因的克隆

为了探索嗜盐放线菌对高盐环境的适应机理,以分离于罗布泊易变链霉菌TRM 45540为材料,利用分子克隆技术,构建四氢嘧啶异源生物合成工程菌(以E.coli为宿主),对ectA、ectB、ectC与ectABC基因进行异源表达,分析异源宿主菌的耐盐能力。结果表明:TRM 45540四氢嘧啶合成相关基因ectA为474bp,预测编码蛋白为19ku;ectB为1 272bp,预测编码蛋白为44.6ku;ectC为399bp,预测编码蛋白为19ku;全长基因ectABC为2 403bp,并且携带有ectABC基因工程菌的耐盐能力显著提高。

牛病毒性腹泻病毒复制相关宿主细胞环状RNA的筛选

为了明确环状RNA(circRNA)在牛病毒性腹泻病毒(BVDV)复制中的作用,用BVDV NADL感染牛肾细胞(MDBK)并进行高通量测序分析,结果获得大量差异表达circRNA,对高通量测序数据进行筛选,共获得了12个上调的circRNA,通过RNase R消化、荧光定量PCR验证及通路分析,初步认为circ-0027407具有抑制病毒复制的可能性。在RNA干扰试验中,设计的干扰片段显著降低了circ-0027407的表达量,降低幅度约为66.1%,使用干扰载体转染MDBK细胞后感染病毒,发现干扰circ-0027407会显著增加病毒复制,提高了约113.2%。说明circ-0027407对BVDV感染有抑制作用。

CRISPR/Cas9系统介导GFP在兔H11位点的定点整合研究

目的家兔是一种重要的模式动物,然而目前家兔中缺乏外源基因定点整合的相关技术。方法为了在兔胚胎成纤维细胞水平建立起成熟的H11位点定点整合平台,试验根据文献报道的人和小鼠的H11位点鉴定出家兔的H11位点,并使用CRISPR/Cas9系统和同源重组技术,设计了两对针对H11位点的sgRNA和左右同源臂,构建敲除载体和打靶载体。将两种载体共同转染进兔胚胎成纤维细胞中,在共转染的细胞基因组中依托嘌呤霉素筛选检测外源基因整合。结果在共转染的兔胚胎成纤维细胞中检测到外源基因插入,并且在敲入后成功表达外源基因。结论该实验依赖于CRISPR/Cas9技术和同源重组技术在细胞水平上创建高效的位点特异性整合系统,为未来转基因兔的安全和有效制备奠定了基础。