大鼠Pik3cb短发卡状RNA对平滑肌细胞增殖的影响

目的:构建大鼠Pik3cb短发卡状RNA(shRNA)真核表达载体,为利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术从转录后水平抑制血管移植术后移植静脉再狭窄的研究做准备。方法:经预实验设计并合成6条shRNA寡核苷酸片段,酶切鉴定和测序正确后挑选2条质粒转染入大鼠胸主动脉平滑肌细胞内,48、72h用荧光显微镜观察转染效率,Western blot检测Phospho-Akt(Ser473)蛋白的表达,流式细胞仪分别在24、48、72、96h检测细胞凋亡数目。结果:构建的两条大鼠Pik3cbshRNA经限制性内切酶酶切和DNA测序正确后分别命名为pU6-Pik3cb-shRNA-1和pU6-Pik3cb-shRNA-2,转染平滑肌细胞48h和72h转染率分别为15.7%和10.1%;Westernblot结果显示转染组Phospho-Akt(Ser473)蛋白表达明显下降;流式结果表明pU6-Pik3cb-shRNA-1和pU6-Pik3cb-shRNA-2组凋亡细胞数目明显增加,与对照组相比有统计学意义(P<0.05),各时间点错配质粒组与正常对照组相比差异无统计学意义。结论:成功构建了2条大鼠Pik3cbshRNA真核表达载体,有效促进凋亡,抑制平滑肌细胞增殖,为靶向Pik3cb的RNAi防治血管再狭窄奠定了基础。

靶向Akt1基因RNA干扰对胸主动脉平滑肌细胞增殖的影响

目的构建兔Akt1短发卡RNA(shRNA)真核表达载体,探讨靶向Akt1基因RNA干扰对兔胸主动脉平滑肌细胞增殖的影响。方法经预实验挑选2条有效短发卡RNA转染入原代培养日本大耳白兔胸主动脉平滑肌细胞内,设置空白对照组(A组)、阴性对照组(B组)、Akt1-shRNA-1组(C组)、Akt1-shRna-2组(D组)。48、72 h荧光显微镜下观察细胞转染效率,分别在转染平滑肌细胞后24、48、72、96 h使用流式细胞仪和TUNEL法检测凋亡细胞数目。结果平滑肌细胞48 h转染效率为17.8%;流式细胞仪测定C组和D组在48 h凋亡率分别为19.72%和15.43%,抑制增值效果达到最高峰,与A、B组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。TUNEL法测定结果表明,C、D组细胞凋亡水平与A、B组比较明显增多(P<0.05),且以C组较为明显。结论成功构建了2条兔Akt1 shRNA真核表达载体,可有效地抑制平滑肌细胞增殖。

大鼠血管移植模型的建立及改进

目的建立一种与冠脉旁路移植术后静脉桥再狭窄病理过程相似的动物模型。方法将一段游离的大鼠颈外静脉分支与同侧颈总动脉行端端吻合,分别于术后1 d,3 d,7 d,14 d,28 d取材,HE染色。结果可见静脉桥管腔狭窄,病理切片显示内膜不同程度增生。结论大鼠颈静脉颈动脉间置模型能真实反映冠脉旁路移植术后静脉桥狭窄的情况,是进一步研究防治静脉桥再狭窄的理想模型。

兔原代胸主动脉平滑肌细胞培养方法及不同浓度血清培养基对其增殖的研究

目的探讨体外分离培养兔原代胸主动脉平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells, VSMCs）技术及在不同浓度血清培养基下生长情况。方法采用组织贴块法进行原代培养，分别用不同浓度血清培养基（10％、15％、20％）对原代VSMCs进行培养．胰酶消化法传代，用倒置显微镜对原代培养兔平滑肌细胞进行形态学观察并鉴定，MTT法测定增殖能力。结果体积分数20％血清的DMEM培养液培养的原代细胞生长出现明显对数期。培养5代的兔平滑肌细胞纯度达97％以上：镜下可见平滑肌细胞生长，免疫组化提示平滑肌细胞肌动蛋白阳性表达，细胞生长第4～5d内光密度值变化较明显。结论本法能有效提高兔动脉平滑肌细胞原代培养的成功率，为研究血管平滑肌细胞生物学行为提供了有效模型。

靶向PIK3cb双位点shRNA干扰抑制血管移植术后再狭窄

目的研究RNA干扰(RNAi)对大鼠血管平滑肌细胞磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)p110β亚单位(PIK3cb)基因表达的干扰效应。方法雄性SD大鼠150只,均行自体颈外静脉-颈总动脉移植手术,随机数字分组法分为6组:空白对照组(25%空白Pluronic F-127)、shRNA-1组、shRNA-2组、1/2(shRNA-1+shRNA-2)组、阴性对照组(无序质粒)和阳性对照组(渥曼青霉素),每组25只。3个转染组〔shRNA-1组、shRNA-2组及1/2(shRNA-1+shRNA-2)组〕通过Pluronic F-127缓释系统将shRNA均匀喷涂于移植静脉周围。分别于术后1、3、7、14及28d各取5只大鼠取材,采用计算机图像分析法测量管腔内膜厚度及新生内膜面积,Western blot(术后3d)及免疫组化染色检测细胞增殖情况。结果术后3、7、14及28d时,3个转染组血管内膜厚度均较空白对照组及阴性对照组明显减少(P<0.05);而新生内膜面积3个转染组(除shRNA-2组第3、7d)于术后1d起即开始明显减少(P<0.05)。免疫组化染色结果示术后各时间点3个转染组PCNA阳性细胞面积百分比显著低于空白对照组及阴性对照组(P<0.05)。Western blot检测结果示术后3d3个转染组PCNA蛋白表达明显低于空白对照组及阴性对照组(P<0.05)。各时间点空白对照组与阴性对照组血管内膜增生情况及PCNA表达情况差异无统计学意义(P>0.05)。结论shRNA真核表达载体转染入移植静脉后能有效抑制管壁平滑肌细胞增殖,是一种防治移植静脉狭窄的基因疗法。

大鼠Pik3cb shRNA质粒的构建及鉴定

目的构建大鼠Pik3cb短发卡状RNA(shRNA)真核表达载体,为利用RNA干扰技术(RNA interference,RNAi)从转录后水平抑制移植术后血管再狭窄的研究做准备。方法根据大鼠Pik3cb mRNA序列设计6条并经预实验挑选出2条shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链并克隆进入载体pGenesil-1,进行酶切鉴定和测序。结果酶切证明构建的shRNA已插入载体,经测序证明与设计的相同,获得大鼠Pik3cb shRNA表达载体质粒。结论成功构建了2条大鼠Pik3cb shRNA真核表达载体,为靶向Pik3cb的RNAi防治血管再狭窄奠定了基础。

RNAi技术在抑制血管平滑肌细胞增殖中的研究进展

移植血管狭窄是影响冠脉旁路移植术后远期疗效的主要原因,其机理包括血管中膜平滑肌细胞表型转化、增殖、迁移至内膜并合成大量的细胞外基质。RNA干扰(RNAi)技术是一种沉默特异基因序列的基因治疗方法,现对其机理及在抑制血管平滑肌细胞增殖中的应用进展进行综述。

经导管取栓及溶栓治疗急性下肢深静脉血栓

目的探讨经导管取栓及溶栓技术治疗急性下肢深静脉血栓的临床价值及疗效。方法收集急性下肢深静脉血栓患者117例,其中中央型血栓71例,混合型血栓46例。在下腔静脉滤器保护下,对患者行经大腔导管取栓及溶栓导管溶栓治疗,对合并Cockett综合征者行支架成形治疗。结果手术成功率100%,患肢肿胀、疼痛于术后当日即明显减轻,无肺栓塞发生。110例患者均成功随访12个月,总有效率97.27%(103/110)。结论经导管取栓及溶栓治疗急性下肢深静脉血栓安全、有效。

大鼠胸主动脉平滑肌细胞的培养与鉴定

目的探讨以简便、高效的方法获取血管平滑肌细胞,为相关研究提供实验材料。方法采用组织贴块法进行原代培养,胰酶消化法传代,并应用相差显微镜和平滑肌肌动蛋白对细胞进行形态学和免疫组化鉴定。结果90%的组织块接种存活,培养5代的平滑肌细胞纯度达98%以上。镜下可见培养细胞呈典型的“峰-谷状”样生长,免疫组化染色显示胞浆内平滑肌肌动蛋白阳性表达。结论本法简便、可靠,短期内可获大量高纯度、功能良好的血管平滑肌细胞,可作为研究心血管疾病良好的体外模型。

无流出道显影的下肢动脉闭塞症腔内血管成形治疗的预探索

目的探讨经皮腔内血管成形术（PTA）治疗无流出道显影的下肢动脉硬化闭塞症（ASO）的临床疗效及价值。方法无流出道显影的下肢ASO患者19例,男11例,女8例,年龄48~79岁,中位年龄66岁。所有患者主要临床症状为患肢静息痛,其中10例（47.6%）伴有不同程度足部溃疡和坏疽。所有患者术前均接受患肢多层螺旋CT血管造影及DSA检查。PTA治疗后随访12个月,观察并记录临床症状和体征变化,于术前和术后1、3、6、12个月分别检测患肢跛行距离、足趾皮温、踝肱指数（ABI）、趾肱指数（TBI）,并作CTA或彩色多普勒超声检查。结果 19例患者共38条病变肢体,54支血管为无流出道显影的下肢动脉闭塞病变,分别为胫前动脉25支（46.3%）、胫后动脉18支（33.3%）、腓动脉9支（16.7%）、腘动脉2支（3.7%）;肢体PTA技术成功率为89.6%,单血管PTA技术成功率为85.2%。术后所有开通成功的患肢皮温改善明显,疼痛症状明显缓解或消失。术后1、3、6、12个月患者跛行距离、足趾皮温、ABI、TBI等均较术前有显著改善（P〈0.05）。术后12个月肢体血管再狭窄率为39.5%（15/38）,肢体血管通畅率为55.3%（21/38）,肢体保全率为81.6%（31/38）。结论 PTA治疗无流出道显影的下肢动脉闭塞病变的近期疗效确切,安全性高;远期再狭窄率虽较高,但能有效控制病情发展并缓解临床症状,有助于提高缺血肢体的保全率。

原发性腹膜后肿瘤的诊断与治疗

目的:探讨原发性腹膜后肿瘤(primary retroperitoneal tumor,PRPT)的诊治经验。方法:回顾性分析2000年1月至2008年6月315例PRPT患者的临床资料和随访结果,总结临床诊治经验。结果:315例原发性腹膜后肿瘤良、恶性之比0.55:1。手术治疗294例,完整切除161例,联合切除69例,部分姑息切除64例;21例未行手术。恶性肿瘤完整切除患者预后优于部分切除(P<0.05)。结论:影像学检查可有效诊断PRPT;手术完整切除肿瘤是PRPT治疗的关键,再次手术是复发性PRPT的有效治疗手段。

电视胸腔镜手术体会

目的探讨胸腔镜手术的适应证、手术方法及手术体会。方法总结我院自2008年11月～2011年1月共开展的电视胸腔镜手术30例手术体会。结果全组无手术死亡,切口均Ⅰ期愈合,术后住院4～37天,术中出血少(10～100ml),无输血病例。结论胸腔镜手术具有微创、出血少、住院时间短、视野清楚、更容易被患者接受等特点,应用广泛。

94例胃肠道间质瘤临床诊治分析

目的:探讨胃肠道间质瘤(GIST)的诊断与治疗。方法:对1998年1月-2007年12月收治的94例GIST患者病理特点及外科治疗进行回顾性分析。结果:本组GIST发生部位:胃54例(57.4%),小肠22例(23.4%),结肠11例(11.7%),直肠6例(6.4%),肛管1例(1.1%)。主要临床表现为消化道出血(56.3%)和腹部肿块(32.1%),94例均行手术切除。术后1年、3年、5年存活率为83.4%、53.2%、38.8%,良性及交界性患者均无复发;23例恶性患者中9例复发,其中5例死亡。结论:GIST以胃及小肠最多见,以消化道出血、腹部肿块表现为主。GIST的诊断有赖于病理形态学检查与免疫组化的结合。完整的手术切除是最有效的治疗手段。

腹腔镜下腹壁巨大切口疝修补术的临床分析

目的探讨腹腔镜下应用补片修补腹壁切口疝的手术方法及临床效果。方法回顾性分析41例腹壁切口疝行腹腔镜下补片修补术患者的临床资料。结果38例均顺利完成手术,3例中转开腹。手术时间78～186min,平均95min。术后疼痛轻微,术后排便、排气时间25～41h,平均32h。术后第2d进食。术后住院5～7d,平均6d。41例随访6～16个月,平均9个月,未见疝复发。结论腹腔镜下采用复合补片修补腹壁切口疝是一种安全、有效的方法,值得临床推广应用。

基于粗糙理论的顾客需求权重确定方法

质量功能展开法是一种由需求驱动的,旨在提高产品质量和顾客满意度的质量评价方法,但是传统质量屋中确定顾客的需求有着过于主观性的缺点,影响质量功能展开法使用的准确性。粗糙理论处理评价信息时无需提供问题所需处理数据之外的任何先验信息,将粗糙理论用于确定初始权重可以降低评价系统的主观性。顾客需求是动态变化的,为了解顾客的稳定性需求,采用马尔科夫链分析需求变化情况。顾客对于不同种类需求的敏感性不同,使用KANO模型分析需求种类对需求权重的影响。最后综合考虑各因素对权重的影响来确定顾客需求最终权重,将此需求权重用于质量功能展开,能够提高质量功能展开法使用的准确性。

基于Fuzzy-QFD的动态联盟合作伙伴选择

随着互联网通信技术的发展,制造业的市场竞争范围逐渐扩大到全球,竞争的激烈程度也因此提高。面对激烈的市场竞争,企业往往通过选择合作伙伴组建动态联盟来快速响应市场,但在选择合作伙伴时一般只重视待选企业的能力因素而忽视了顾客需求。通过将模糊理论与质量功能展开相结合,在评价和选择合作伙伴时采用二维评价指标,即服务需求因子和能力因子,运用质量功能展开(quality function deployment,QFD)将服务需求因子内嵌到能力因子中,再根据专家对各合作伙伴能力因子的评价选择合作伙伴。将顾客需求贯穿到产品设计生产的全过程,由此保证虚拟企业的产品能够满足顾客的需求。