Klotho基因沉默对肾小管上皮细胞草酸钙晶体粘附的影响

目的 探讨短发夹RNA(shRNA)稳定转染方法沉默Klotho基因对草酸钙晶体诱导人肾小管上皮细胞氧化应激及粘附的影响。方法 肾小管上皮细胞分为Ctrl、shRNA-NC、shRNA-Klotho、COM、shRNA-Klotho+COM组。ELISA检测5组氧化应激指标谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、血红素氧合酶1(HO-1)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)水平。Western blot检测5组Klotho蛋白水平。AlexaFluor-488-标记钙检测草酸钙晶体的黏附。结果 与Ctrl组相比,shRNA-Klotho组GSH、SOD、HO-1含量均显著降低(P<0.05),而MDA及ROS含量显著增高(P<0.05)。与Ctrl组相比,shRNA-Klotho组Klotho蛋白表达水下调(P<0.05);与其他组相比,shRNA-Klotho+COM组Klotho蛋白表达水平下调最为明显(P<0.05)。与COM组相比,shRNA-Klotho+COM组草酸钙晶体黏附增加了123.47%(P<0.05)。结论 沉默Klotho基因可加重草酸钙诱导的人肾小管上皮细胞氧化应激,并使草酸钙晶体对肾小管上皮细胞的黏附增加。

Klotho基因与新疆地区维吾尔族、汉族特发性草酸钙肾结石的相关性

目的探讨Klotho基因rs3752472、rs564481、rs1456824303个位点多态性与新疆地区维吾尔族、汉族特发性草酸钙肾结石(ICOS)的相关性。方法选择399例维吾尔族特发性草酸钙肾结石患者(维族病例组)、410例维吾尔族健康体检者(维族对照组)、412例汉族特发性草酸钙肾结石患者(汉族病例组)、400例汉族健康体检者(汉族对照组),应用SnaPshot方法对Klotho基因rs3752472、rs564481、rs145682430的3个位点进行基因检测。结果rs3752472在汉族病例组和汉族对照组中CC基因型与含T基因型存在差异[OR=0.518,95%CI(0.349~0.768),P<0.05],CC纯合子基因型比TT纯合子基因型和CT杂合子基因型携带者发生ICOS的风险降低0.518倍,rs3752472的CC基因型与含T基因型在维族病例组和汉族病例组中具有差异[OR=1.708,95%CI(1.164~2.506),P<0.05];rs564481在维族对照组和汉族对照组中CC基因型与含T基因型存在差异[OR=0.510,95%CI(0.386~0.675),P<0.05];rs564481在维族病例组和汉族病例组中CC基因型与含T基因型存在差异[OR=0.551,95%CI(0.416~0.731),P<0.05]。与汉族病例组相比,rs145682430的CC基因型在维族病例组中出现频率更高[OR=5.703,95%CI(2.363~13.767),P<0.05]。结论Klotho基因rs3752472位点在汉族病例组和汉族对照组比较中,C等位基因是新疆地区汉族人群特发性草酸钙肾结石发病的保护因素,rs145682430、rs564481等位基因C则更易出现在汉族(病例组和对照组)人群中,但与汉族人群的发病未见明显相关。

Klotho基因敲降或过表达对乙醛酸盐诱导的小鼠肾结石模型的影响及机制研究

目的调控Klotho基因观察草酸钙晶体对小鼠氧化损伤、细胞凋亡及晶体黏附的影响。方法选取新疆医科大学动物实验室8周龄C57BL/6雄性小鼠30只,构建过表达/沉默Klotho基因小鼠肾结石模型,将模型简单随机抽样法分为分为对照组(Ctrl)组(n=6)、草酸钙结石模型(Model)组(n=6)、模型+生理盐水(Model+Vector)组(n=6)、基因沉默+模型(shKlotho+Model)组(n=6)和基因过表达+模型(Klotho+Model)组(n=6)。应用免疫印迹实验(Western blot)和聚合酶链反应(PCR)检测蛋白级信使RNA(mRNA)的表达;酶联免疫测定(ELISA)检测氧化应激蛋白水平。苏木精-伊红(HE)色观察肾脏病理改变,风库萨(Von Kossa)染色观察肾脏草酸钙晶体黏附情况。脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)法检测肾组织细胞凋亡。两组间统计学差异采用t检验,多组间统计学差异采用单因素方差分析。结果本课题组在体内建立了小鼠草酸钙结石模型,并通过Von Kossa染色验证模型。Model组血清中过氧化氢酶(CAT)[(6.25±0.84)U/ml比(9.55±1.42)U/ml]、谷胱甘肽(GSH)[(4.83±0.64)mg/L比(8.05±0.89)mg/L]、血红素氧化酶(HO-1)[(0.79±0.08)ng/ml比(1.44±0.18)ng/ml]的表达显著下降,乳酸脱氢酶(LDH)[(353.89±51.37)U/L比(179.07±25.87)U/L]的表达显著上升,Ctrl组则相反,差异有统计学意义(F=25.785、39.313、38.321、139.411,P<0.01)。HE和Von Kossa染色发现,Model组部分肾小管变性坏死,Klotho+Model组草酸钙晶体的沉积与黏附面积小于shKlotho+Model组[(9.50±0.54)%比(2.16±0.75)%]。TUNEL染色结果显示,Model组小鼠肾组织中凋亡情况显著增加(9.67±0.81)。shKlotho+Model组细胞凋亡水平明显高于Klotho+Model组[(13.33±0.52)%比(3.83±0.75)%,F=303.615,P<0.01]。Model组细胞凋亡关键蛋白半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-3的mRNA及蛋白表达显著上调[(2.15±0.29)ng/ml],B淋巴细胞瘤2(bcl-2)的mRNA表达显著下调[(0.48±0.05)U/L]。shKlotho+Model组氧化应激关键蛋白核因子E2相关因子(Nrf2)[(0.24±0.05)U/L比(1.06±0.10)U/L],HO-1[(0.24±0.04)U/L比(1.05±0.10)U/L],昆氧化还原酶(NQO-1)[(0.28±0.03)U/L比(1.01±0.11)U/L]的mRNA及蛋白水平低于Klotho+Model组(F=139.461、140.063、115.110,P<0.01)。结论Klotho通过Keap1-Nrf2-ARE信号通路抑制草酸钙结石小鼠的氧化损伤、细胞凋亡及晶体黏附。

萝卜硫素通过Nrf2信号通路对大鼠草酸钙肾结石形成的作用和机制研究

目的:探究萝卜硫素通过Nrf2信号通路对大鼠草酸钙肾结石形成的作用和机制。方法:选取7~8周龄Wistar健康雄性大鼠30只,随机分为空白对照组、模型组和药物干预组。空白对照组给予正常饮用水,标准饲料;模型组给予1%乙二醇饮用水+2%氯化铵2 mL/d灌胃,标准饲料;药物干预组给予1%乙二醇饮用水+2%氯化铵2 mL/d灌胃+0.2 mg萝卜硫素腹腔注射,标准饲料。灌胃给药均连续28天。于第29天收分别集各组大鼠24 h尿液及肾脏标本,使用全自动生化分析仪检测尿液中K^(+)、Na^(+)、Cl^(+)、Ca^(2+)、Mg^(2+)、P^(5+)、Fe^(2+)含量,使用ELISA法测定尿液中丙二醛(malondialdehyde,MDA)与草酸水平,使用HE染色分析大鼠肾脏标本病理损伤情况,Von Kossa染色比较各组大鼠钙盐沉积情况,免疫组化法测定谷胱甘肽(glutathione,GSH)、核因子E_(2)相关因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2)、8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-2 deoxyguanosine,8-OHDG)蛋白表达水平。结果:模型组大鼠尿液P^(5+)、Ca^(2+)、草酸、MDA含量显著高于空白对照组,HE染色示模型组肾小管较空白对照组变性严重,Von Kossa染色结果显示模型组钙盐沉积较空白对照组明显增多,模型组GSH、Nrf2免疫组化评分显著低于空白对照组,8-OHdG显著高于空白对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);药物干预组大鼠尿液P^(5+)、Ca^(2+)、草酸、MDA含量显著低于模型组,HE染色、Von Kossa染色显示肾小管较模型组损伤减轻,钙盐沉积较模型组减轻,免疫组化显示GSH、Nrf2蛋白表达显著高于模型组,8-OHdG显著低于空白对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:萝卜硫素对大鼠肾小管具有抗氧化损伤作用,可降低草酸钙晶体的释放,抑制草酸钙结石的形成,该作用可能是通过激活Nrf2蛋白及其下游信号通路实现的。