高通量测序技术在宏基因组学中的应用

随着生命科学及研究技术的不断发展，人们对生命现象的了解更加深入。微生物因为其在工业、农业、医疗卫生、环境保护等各方面的重要地位，被越来越多的研究者关注。

高通量测序技术在临床医学中的应用进展

高通量测序技术(第二代测序技术)近年来取得快速发展,与第一代测序技术相比具有速度快、准确率高、成本低等优点,主要以454测序技术、Solexa测序技术以及SOLiD测序技术为代表。高通量测序技术在生命科学以及医学领域方面的研究越来越广泛,该文介绍了几种高通量测序技术的作用原理以及它们在临床方面的应用情况。

RD-PCR技术在酵母基因表达谱研究中的应用

目的 应用RD PCR技术分离酵母基因。方法 首先提取酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)总RNA ,纯化mRNA ;然后 ,反转录成双链cDNA ;再用限制性内切酶Sau3AI酶切 ,在酶切片段上加上接头后 ,用通用引物U进行第一次PCR扩增 ,以这一产物为模板用选择性引物(在通用引物的 3’端延伸两个碱基 )作第二次PCR扩增。 5 %PAGE胶分离基因片段 ,选择单带割胶回收 ,做第三次PCR扩增 ,与载体连接 ,最后进行测序分析。结果 采用这种方法分离得到的基因片段 ,经Blast检索分析 ,确为来自酿酒酵母基因的cDNA片段或表达序列标签 (EST)。结论 RD PCR技术可以有效地分离EST ,可用于酵母基因表达调控的研究。

关于校级基因组测序平台管理的探讨

2010年清华大学基因组测序平台建立以来,为校内外的研究工作者提供了良好、可靠的实验服务。为了提高服务质量,初步建立了GLP实验室,制定了相关文件和文档。该文从良好实验室规范、质量保证、质量控制、标准操作程序等几个方面探讨了校级基因组测序平台管理的问题。

超声波破碎仪在高通量测序中的应用

高通量测序技术中的数据质量控制是测序过程中的重要问题,样本文库的质量则是获取高质量的测序数据的前提和基础。在各种样本文库的制备过程中,样本的片段化过程受到普遍关注。该文主要针对基因组DNA样本的片段化技术中,涉及到的非接触式全自动超声破碎仪Bioruptor和自动聚焦声波样本处理仪Covaris S220的使用技巧和仪器的优缺点进行了初步比较。

基因诊断先天性耳聋的临床应用现状与展望

GJB2基因突变的检出率在我国为13.6%～21.5%,其中299-300delAT与233-235delC为我国非综合征性耳聋患者GJB2基因最常见的突变。在药物性耳聋发病中遗传因素起着至关重要的作用,其分子病理机制为线粒体内DNAA1555G突变利于12SrRNA与氨基糖苷类抗生素的结合,使得细胞膜对Ca2+通透性增加,从而导致毛细胞的死亡或者凋亡。SLC26A4在感音神经性耳聋耳聋中约占1%～12%的比例。最常见的SLC26A4基因突变为IVS7-2>G。

复杂疾病关联研究进展

复杂疾病关联研究随着大规模基因组测序、高通量芯片及质谱技术等的突破,也得到了迅速的发展。该文以笔者实践科研经验为基础,结合国内外相关文献,尤其是国际人类基因组单体型图计划相关研究,从复杂疾病的基本概念和特点入手,就复杂疾病关联研究中的主要问题、方法进行了综述,并就复杂疾病关联研究未来可能的走向做出了预测。

应用十六烷基三甲基溴化铵纯化PCR产物

目的建立应用十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyltrimethyl ammonium bromide, CTAB)PCR产物纯化的方法。方法应用CTAB对PCR产物进行选择性沉淀。CTAB与DNA形成复合我1.2 mol/L NaCl溶液中溶解,再用乙醇将PCR产物沉淀出来。结果这种方法可以去除PCR产物中引物和小分子dNTP。虽然纯化的产率占现在市场上的一些试剂盒产率的80%,但其成本比较低,仍不失是一种PCR产物纯化的方法。结论利用十六烷基三甲基溴化铵可以用于PCR产物纯化。

SH-SY5Y细胞基因片段文库及其数据库的建立

目的 建立SH SY5Y细胞基因片段文库和一种对大量cDNA片段数据管理系统的方法。方法 采用RD PCR技术构建SH SY5Y细胞基因片段文库 ,并对每一个克隆进行测序。应用FOXPRO编制一个软件对其大量的信息进行系统化管理。结果 应用RD PCR技术建立了细胞的cDNA片段文库 ,由 12 0 0余个片段克隆组成 ;应用FOXPRO制作了基因片段数据信息管理系统的软件 ,对此文库片段的测序数据进行管理。结论 采用RD PCR技术是一个很好的建立基因片段文库的方法 ;建立了基因片段数据信息管理系统的软件进行这个文库数据的管理。

银染RD-PCR方法分离基因片段

从正常培养的SH-SY5Y细胞中提取总RNA,经oligo(dT)纤维素柱纯化分离出mRNA,然后以oligo(dT18)为锚定引物反转录生成单链cDNA再以此为模板合成DNA的第二条链;将双链DNA经Sau3AI酶切之后,接上接头,经通用引物和选择性引物进行扩增;采用5%非变性PAGE胶电泳分离后,用银染的方法显示DNA条带;在直视下回收DNA带,经过扩增后克隆入pMD18-T载体中并鉴定。结果建立了非放射性同位素的银染RD-PCR方法,用于分离基因片段。

一个表达序列标签的克隆——应用限制性显示技术

目的应用限制性显示PCR(restrictiondisplaypolymerasechainreaction,RD-PCR)技术分离克隆SH-SY5Y细胞的基因片段。方法从SH-SY5Y细胞中分离提纯mRNA,然后以Oligo(dT18)为锚定引物反转录生成单链cDNA,再以此为模板合成DNA的第二条链;将双链DNA经Sau3AⅠ酶切之后,接上接头,经通用引物和选择性引物扩增后,与载体pMD18相连,克隆、测序。结果分离出一段cDNA,经Blast分析,发现与基因组17号染色体的一段序列具有高度的相似性,运用GenScan分析这段DNA序列,提示这段表达序列标签(expressedsequencetag,EST)可能是一个未知基因的一部分。结论RD-PCR技术是一种简便、有效的分离克隆基因片段的方法,运用生物信息学对EST的染色体定位以及下一步的实验可能具有一定的指导意义。

器官形成期高温暴露对大鼠胚胎生长发育的影响

目的探讨高温暴露对器官形成期胚胎生长发育的影响。方法将15只健康成年未生育清洁级的SD孕鼠随机分为对照组、高温暴露30min组、高温暴露60min组,每组5只。孕鼠于妊娠第8～10天分别暴露于(39.5±0.5)℃的高温环境中。在妊娠第11天检测孕鼠血清中乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶(CK)活力及胚胎数、头长和畸形率以及胎鼠脑蛋白质与HSP70含量。结果与对照组比较,高温暴露60min组孕鼠血清中LDH和CK活力均升高,差异有统计学意义(P<0.05)。而高温暴露30min组和对照组孕鼠血清中LDH和CK活力间比较,差异均无统计学意义。随着高温暴露时间的延长,胎鼠头长和脑蛋白质含量呈下降趋势,畸形率和HSP70含量呈上升趋势;但各高温暴露组胎鼠胎鼠头长、畸形率、HSP70含量和脑蛋白质含量间比较,差异均无统计学意义。结论器官形成期孕鼠高温暴露对胎鼠的生长发育产生不良影响。