中国明对虾C-型凝集素基因(Fclectin)的重组表达及活性分析

研究拟通过分析对虾C型凝集素的活性特点,探讨其在对虾先天免疫应答过程中的潜在功能以及在养殖生产实践中的应用。实验利用原核表达系统对中国明对虾C-型凝集素基因的两个串联的糖识别结构域(carbohydrate recognition domain,CRD)进行了重组表达,并通过纯化复性获得了重组目的蛋白(rFclectin-CRD1和rFclectin-CRD2)。活性分析结果显示,重组目的蛋白对多种病原菌有凝集和抑制生长的作用,并且具有Ca2+依赖活性;其凝集活性可被半乳糖、肽聚糖、脂多糖等多种病原相关分子模式所抑制,研究结果证实,Fclectin是一种典型的C-型凝集素,它可能作为中国明对虾先天免疫中重要的模式识别受体,在一定程度上参与了机体应答病原微生物的防御过程。

DNA去甲基化特征、功能及其在节肢动物中的研究现状

DNA甲基化作为表观遗传学中重要的修饰方式之一,其动态变化对生物生长发育和适应环境的能力具有显著影响.其中,DNA去甲基化途径在动物的发育、脑可塑性、基因组印记以及由环境胁迫引起的转录调控中有着重要作用.本文首先对DNA去甲基化的作用机制以及功能进行综述;其次,对其在节肢动物中的研究现状进行了介绍;最后进行总结和今后研究的展望.

中华绒螯蟹蜕皮抑制激素基因全长cDNA克隆和重组表达

根据实验室分离自中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)的一种蜕皮抑制激素(Molting-inhibiting hormone,MIH)N端氨基酸测序结果设计简并引物,采用RACE方法,首次从中华绒螯蟹眼柄中克隆到蜕皮抑制激素基因全长cDNA(Es-MIH,GenBank登录号:DQ341280),该基因全长为1457 bp,开放阅读框为330 bp,编码110个氨基酸(含有35个氨基酸的信号肽);其成熟肽包含C7-C44、C24-C40和C27-C53三个二硫键,有典型的CHH家族结构域。该cDNA编码的氨基酸序列与地蟹(Gecarcinus lateralis)MIH同源性最高,达到了85%。Northern杂交和半定量RT-PCR显示蜕皮间期成体蟹仅在眼柄中有MIH基因表达,提示该基因的表达具有一定组织特异性。利用pCR T7/NT TOPO TA系统重组表达MIH成熟肽,纯化的重组蛋白得率为0.3 g/L,纯化产物经质谱鉴定为中华绒螯蟹MIH。研究解决了CHH家族神经肽在机体中的表达量少,直接纯化较难的问题,为深入研究MIH的作用机制和在生产上控制中华绒螯蟹蜕皮和生长奠定了基础。

钙激活钾通道在中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)血淋巴细胞免疫中的作用研究

采用膜片钳技术解析了中华绒螯蟹血淋巴细胞表达的大电导钙激活钾通道(BKCa),研究了中华绒螯蟹BKCa对血淋巴细胞吞噬和杀菌作用的影响,并探讨了其机制。结果表明,当Ca2+浓度在0.3—3.0μmol/L范围时,中华绒螯蟹血淋巴细胞表达的钙激活钾通道的开放表现出明显的钙依赖活性;培养液中游离Ca2+的添加显著增强了血淋巴细胞的杀菌能力和呼吸爆发活性,但对其吞噬率和吞噬指数的影响不显著;在6mmol/L[Ca2+]浓度条件下,加入不同浓度的KCa阻断剂四乙胺(Tetraethylammonium,TEA)后,血淋巴细胞的杀菌能力和呼吸爆发活性均显著降低,但其吞噬率和吞噬指数并未受到影响。这提示钙激活钾通道可能通过间接调节细胞内的钙离子浓度而在血淋巴细胞杀菌过程中发挥重要作用。

凡纳滨对虾肠道内产消化酶益生菌的分离与筛选

为获得具有消化酶活性且安全的益生菌,从凡纳滨对虾肠道中初步分离得到576株细菌,对菌株进行产蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶能力的定性及定量测试,筛选出产酶种类多且产酶能力强的菌株11株。对筛选出的11株菌进行了幼虾浸浴实验、药敏性实验和溶血性实验,以评价其生物安全性。将11株菌的菌悬液添加到凡纳滨对虾幼虾的养殖水体中进行浸浴实验,浸浴结束后用鳗弧菌进行刺激,测定不同浸浴组幼虾相关免疫基因的相对表达量,以确定其对幼虾的保护效果。综合消化酶活性、菌株对幼虾的保护效果及生物安全性,筛选得到4株效果较好的菌株。菌株的16S r DNA分子鉴定结果表明,细菌1号、2号和4号分别与芽孢杆菌(Bacillus sp.PCSAS2-38,GQ284495.1)、蜡样芽孢杆菌(B.cereus strain N419,JN400121.1)及苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis strain EA26.1,KC758847.1)的相似性均为100%,9号菌株与荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus strain PSB-03,FJ866782.1)相似性达到99%,为后续益生菌制剂的开发奠定了前期基础。

凡纳滨对虾AP-1基因的克隆和表达特征分析

为了探讨凡纳滨对虾转录因子AP-1在病毒引发的免疫应答过程中的潜在作用,实验根据前期的转录组和表达谱结果提示信息,首次克隆了凡纳滨对虾AP-1基因(LvAP-1,GenBank注册号:KF999956),利用在线软件进行了生物信息学分析,运用半定量的方法进行了组织表达分析,并利用实时荧光定量PCR(qPCR)技术分析了该基因在白斑杆状病毒(WSSV)侵染过程中的表达变化特征。结果显示,AP-1基因ORF区全长882 bp,编码293个氨基酸。预测分析显示该基因编码的蛋白质含有1个Jun结构域和1个高度保守的亮氨酸拉链结构域(bZIP),其中Jun结构域在非脊椎动物中保守性不高。组织表达分析表明,该基因在凡纳滨对虾各组织中广泛表达,其中在血细胞中表达量最高。在WSSV感染早期(0.5 hpi),该基因表达没有显著改变,感染后5 h(5 hpi),AP-1基因开始显著上调表达,在人工感染后24 h,该基因的表达量达到最高(P<0.01)。研究表明,该基因在一定程度上参与了凡纳滨对虾体内由WSSV引发的先天免疫应答过程,为进一步研究LvAP-1在对虾应答病毒侵染过程中的功能和作用机制奠定了基础。

中华绒螯蟹蜕皮激素受体基因(Ers-EcR)的克隆和组织表达分析

蜕皮激素受体(ecdysteroid receptor,EcR)介导调控甲壳动物蜕皮生长、附肢再生等重要生命活动。为了解EcR在人工控制甲壳动物的繁殖和生长中的作用,采用RACE方法结合同源克隆技术,首次从中华绒螯蟹Y-器官中克隆得到蜕皮激素受体基因全长cDNA序列(Ers-EcR,登录号:KF736985),并进行了结构解析和组织表达分析。结果发现,Ers-EcR编码基因全长2 176 bp,开放阅读框为1 638 bp,编码545个氨基酸,具有DNA结合域(DBD)和配体结合域(LBD)等典型的核受体超家族结构域,但不具有信号肽结构。其中,DBD含有8个保守的Cys残基,可以形成2个锌指结构(C156-C159-C173-C176、C192-C198-C208-C211),是典型的DBD特征。多重序列比对分析表明,Ers-EcR氨基酸序列与拳手招潮蟹同源性最高,达到91%。荧光定量PCR结果显示成体中华绒螯蟹ErsEcR基因在Y-器官和肌肉组织中表达量最高,在血液、肠道、卵巢、眼柄、心脏和肝胰腺中有一定表达,在鳃、胸神经节和精巢表达量较低。这表明Ers-EcR基因在中华绒螯蟹各组织器官中的表达不具有典型的特异性,提示Ers-EcR基因可能参与体内多种生命活动的调控。

中华绒螯蟹高血糖激素基因的克隆和分子结构解析

为深入研究中华绒螯蟹高血糖激素(crustacean hyperglycemic hormone,CHH)基因的结构与功能,首次从中华绒螯蟹眼柄中克隆得到高血糖激素基因的全长cDNA序列(Ers-CHH,GenBank登录号:JX485664)。序列及分子结构分析结果显示:Ers-CHH基因全长585 bp,ORF区为453 bp,编码150个氨基酸,N端30个氨基酸为预测的信号肽区域,其后为42个氨基酸的前体相关肽和78个氨基酸的成熟肽。其成熟肽区具有典型的CHH家族结构域,包括3个二硫键C7-C43、C23-C39、C26-C52和4个α螺旋(alpha-helix),但不具有β折叠结构(beta-sheet)。Ers-CHH成熟肽氨基酸序列与溪蟹相比有92%的相似性;其三维结构与其它物种CHH三维结构比较结果显示,4个α螺旋所处的位置及所含氨基酸的相似性较高。与中华绒螯蟹MIH相比,CHH序列前段缺少一个螺旋,但其4个α螺旋的位置及氨基酸数目与MIH的α2-α5螺旋高度一致,空间结构也基本相同,这可能是两种激素功能部分重叠的分子基础。上述结果为进一步研究CHH在中华绒螯蟹生长发育及能量代谢过程中的调节机制和人工控制甲壳动物生长代谢提供了重要信息。

凡纳滨对虾信号转导及转录激活因子(Lv-STAT)基因的克隆及表达特征分析

信号传导及转录激活因子(STAT)是生物体内重要信号通路JAK/STAT的关键组分,在机体免疫、生长、发育等方面起到重要作用。实验从凡纳滨对虾血细胞中克隆获得了STAT基因的全长cDNA序列(Lv-STAT,GenBank accession number:KC779541),其ORF区全长2 373 bp,编码790个氨基酸,预测的分子量为90.68 ku,等电点为5.91。利用SMART在线软件分析表明,该基因编码的蛋白主要结构域由STAT_int、STAT-α、STAT-β和SH2 domain 4部分组成,但不具有信号肽结构。将Lv-STAT与来源于其它物种的STAT进行氨基酸多序列比对后发现,该基因家族中的关键位点在Lv-STAT中同样保守。系统发生分析结果显示,Lv-STAT与斑节对虾、中国明对虾的STAT亲缘关系最近。在组织表达模式分析基础上进一步研究了该基因应答WSSV感染的表达变化特征,发现在感染后早期(0.5、1和3 h),该基因在血细胞中均呈显著上调表达趋势,上述研究表明该基因在一定程度上参与了凡纳滨对虾体内由WSSV引发的先天免疫应答过程。

凡纳滨对虾泛素交联酶E2基因的克隆及表达分析

首先在凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)转录组测序的基础上,应用RT-PCR方法获得了凡纳滨对虾泛素交联酶E2(UE2)基因的开放阅读框序列。该序列长为447 bp,编码148个氨基酸,理论相对分子量为16.84 kD,等电点为4.90。同源性比对和系统进化分析显示,不同物种的UE2基因具有较高的同源性,其中凡纳滨对虾与中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)的同源性最高并聚为一支。半定量RT-PCR分析表明,UE2基因在所检测的组织中均有表达;实时定量PCR分析表明,UE2基因在肝胰腺和肠中的表达量最高,在心脏、鳃、胃和肌肉组织中的表达量略低,在血淋巴中的表达量最低。原核表达分析结果显示,PCR?T7/NT-Topo TA-UE2表达载体在1.0 mmol/L IPTG、37℃诱导3 h条件下可获得纯度较高的分子量约17 kD的蛋白。利用亲和层析的方法将蛋白进行纯化用以制备抗体。研究结果将为深入研究UE2基因在对虾白斑综合症病毒侵染过程中的作用机制奠定基础。

中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)丝氨酸蛋白酶同源物基因(Fc-SPH)的重组表达及活性分析

以实验室前期克隆到的中国明对虾丝氨酸蛋白酶同源物基因(Fc-SPH)(GenBank登录号:DQ318859)为基础,利用原核表达系统对Fc-SPH基因成熟肽区域进行了重组表达和纯化复性分析,并对获得的重组目的蛋白开展了抑菌活性及微生物清除功能研究。结果表明:在体外成功获得了大量有活性的对虾Fc-SPH蛋白(rFc-SPH),活性研究显示rFc-SPH对大多数受试菌种都有明显的抑制效果,并可以加速中国明对虾清除体内外源微生物的速度。作者推断Fc-SPH即可以作为一线防御应答效应物直接参与虾类的先天免疫活动而发挥作用,也可以通过调理作用促进血细胞对病原微生物的吞噬和杀灭。

凡纳滨对虾细胞因子信号转导负调控因子基因(Lv-SOCS)的克隆及特征分析

为了探讨凡纳滨对虾细胞因子信号转导负调控因子（SOCS）在病毒引发的免疫应答过程中的潜在作用,本实验根据前期的转录组和表达谱结果提示信息,首次克隆了凡纳滨对虾的SOCS基因（Lv-SOCS,GenBank注册号：KJ000426）,利用在线软件进行了生物信息学分析,运用半定量的方法进行了组织表达分析,并利用实时荧光定量PCR（qPCR）技术分析了该基因在白斑杆状病毒（WSSV）侵染过程中的表达变化特征。结果显示,Lv-SOCS的ORF区1 191 bp,编码397个氨基酸,预测分析显示该基因编码的蛋白质含有1个SH2结构域和1个SOCS-box结构域,组织表达分析表明该基因主要在凡纳滨对虾血细胞、肠道和肝胰腺中表达。在WSSV感染后中晚期（6~48 hpi）,Lv-SOCS可以被显著诱导,在血细胞中呈明显上调表达趋势,表明该基因在一定程度上参与了凡纳滨对虾体内由WSSV引发的先天免疫应答过程,上述结果为进一步研究Lv-SOCS基因在对虾应答病毒侵染过程中的功能和作用机制奠定了基础。

中国明对虾和中华绒螯蟹EST的Blast2GO注释及其在免疫基因分布研究中的应用

以dbEST数据库中公布的中国明对虾和中华绒螯蟹的EST序列作为数据源,利用CAP3对其进行聚类拼接,采用Blast2GO软件进行功能注释,并通过查找免疫相关的GO注释和检索免疫关键词的方法寻找免疫相关基因,经与不同物种免疫基因的比较,推测可能的免疫基因序列,并进一步分析免疫基因在不同组织和细胞中的分布.结果表明,通过注释和关键词进行筛选这2种方法具有较好的互补性;预测了位于中国明对虾头胸部的60个可能的免疫基因以及位于中华绒螯蟹血细胞hemocyte、haemocyte、肝胰腺、性腺和精巢中的250个免疫基因,这些基因包括模式识别受体、抗氧化蛋白、抗菌肽、凝集素等,其中部分参与酚氧化酶原激活系统、Toll信号通路等重要免疫过程.中华绒螯蟹血细胞中具有种类丰富的免疫基因,与已有的甲壳动物免疫系统相符合.肝胰腺中发现了模式识别蛋白、蛋白酶以及数量众多的凝集素种类,提示肝胰腺在免疫过程中也发挥了一定作用.

鱼类血细胞研究进展

鱼类血细胞研究对于系统了解其免疫系统的应答机制及鱼类疾病的防控具有重要意义。从血细胞发生、发育及分化、功能及研究方法 4个方面综述了鱼类血细胞研究进展,并对其今后的研究方向进行了展望。

图像辅助流式细胞仪在中华绒螯蟹血细胞分析中的应用

[目的]探讨图像辅助流式细胞仪在中华绒螯蟹血细胞分类中的应用。[方法]建立了一种基于新型图像辅助流式细胞仪的自动化方法,并与显微镜观察对比,分析其在中华绒螯蟹血细胞分类方面的效果。[结果]2种方法均显示中华绒螯蟹血细胞可根据胞内颗粒差异分为4类。利用该研究建立的新方法测量河蟹血淋巴中无颗粒、小颗粒、中颗粒和大颗粒细胞的比例分别为(54.33±3.38)%、(27.63±2.10)%、(5.43±0.35)%和(12.51±3.38)%。由于显微镜参考的是可辨识的颗粒结构,而流式细胞仪则根据反映胞内全部颗粒差异的色散测量结果进行分类,因此2种方法的分析结果既有联系又不完全一致。[结论]上述结果提示中华绒螯蟹的各种血细胞之间还有尚未了解的差异,因此可能存在更多的细胞种类。图像辅助流式细胞仪既可以清晰地划定设门区间,又能通过图像佐证结果的准确性,还可凭借其高通量分析能力进一步确保结果的可靠性。该方法有助于促进水生动物血细胞的自动化分类分析与研究。

中国明对虾serpin型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的重组表达及活性分析

Serpin家族成员作为主要的丝氨酸蛋白酶抑制剂,通过调节一系列丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶的活性来调节蛋白酶级联反应,进而参与了包括血液凝结、补体激活、纤维蛋白溶解、炎症反应、肿瘤抑制和激素转运等大量的基本生物过程,在调节机体免疫及其它重要生理功能等方面发挥着重要作用。在前期研究中,从中国明对虾血细胞中克隆得到一个serpin型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因(Fc-serpin,GenBank登录号:DQ318857),初步研究显示它在转录水平参与了病原菌和白斑杆状病毒(WSSV)引发的中国明对虾先天免疫应答反应;利用原核重组表达系统,成功获得了重组的中国明对虾serpin型丝氨酸蛋白酶抑制剂(rFc-serpin),纯化复性后得率为0.3 g/L;活性分析显示,重组目的蛋白(rFc-serpin)对多种病原菌的生长均有一定抑制作用,研究结果进一步证实它参与病原微生物引发的对虾防御应答过程,为探讨甲壳动物先天免疫防御应答机制提供了有价值的参考。

文蛤和菲律宾蛤仔血细胞的图像流式分类分析

[目的]探讨新型图像流式细胞仪在贝类血细胞分类中的应用。[方法]建立了一种基于血细胞侧向散射强度和面积测量的自动化方法,并与显微观察对比其在文蛤和菲律宾蛤仔血细胞分类中的效果。[结果]参考显微镜下可辨识的胞内颗粒结构,2种贝类的血细胞均可分为无颗粒、小颗粒及大颗粒3类,但基于人工辨识的统计结果缺乏量化标准,因此波动较大。图像流式细胞仪通过定量分析可以获得更精细、准确的测量结果。根据侧向散射强度和面积差异,将文蛤和菲律宾蛤仔的血细胞分成无颗粒、小颗粒、中颗粒及大颗粒4类,占比分别为(6.59±1.11)%和(30.03±1.87)%、(34.85±2.95)%和(58.50±5.73)%、(21.95±0.75)%和(6.03±1.44)%、(36.75±4.75)%和(5.36±2.38)%。2种贝类血细胞都呈现出由无颗粒细胞到大颗粒细胞逐渐增大的趋势。[结论]2种方法的分析结果既有联系又不完全一致。相较于显微观察,图像流式细胞仪利用精确的量化标准可辨识出更多的细胞类群,提示综合利用不同的特征差异还可以获得更精细的分类结果。此外,自动化的定量测量准确性好、通量高,是今后贝类血细胞分析的重要方法。

牙鲆(Paralichthys olivaceus)β诺达病毒衣壳蛋白重组表达及复性条件优化

β诺达病毒利用其缺乏校正功能的聚合酶进行基因组复制,易导致突变,因而具有广泛的宿主感染性,而且可引发致死率极高的病毒性神经坏死症,需要有针对性地研究检测及防御方法。本研究以感染牙鲆(Paralichthys olivaceus)的β诺达病毒为对象,利用引物设计,将His标签编码序列连接到完整病毒衣壳蛋白C端,构建原核表达载体;采用SDS-PAGE及质谱对表达产物进行分离和鉴定;重组衣壳蛋白经镍离子亲和柱纯化后进行复性条件的正交优化。结果表明4个肽段经质谱鉴定与预期一致;纯化产物产量可达36mg/L;4°C条件下,复性缓冲液中尿素和PBS的最适浓度为0.8mol/L和0.05mol/L。本研究建立的制备方案可为研制相关疫苗以及开发针对该病毒的快速检测产品等提供有价值的参考。

图像辅助流式细胞仪在鲫鱼血细胞分析中的应用

[目的]探讨图像辅助流式细胞仪在鲫鱼血细胞分析中的应用。[方法]将图像辅助流式细胞仪引入鲫鱼血细胞分类计数分析,并进一步用于急性铜离子胁迫对鲫鱼血细胞影响的机制探讨。[结果]多维全景分析仪独有的图像辨识功能较好地解决了有核红细胞对不同类群细胞分群设门分析的干扰,测量鲫鱼白细胞类群占比为1.18%~1.43%,与同类研究结果一致;120 mg/L铜离子急性刺激能够导致鲫鱼白细胞计数下降,并提示细胞水肿是铜离子的一种急性毒性效应。[结论]该研究建立了一种适用于含有核红细胞样本的操作简便、自动化程度较高的血细胞分群分析方法,可为同类研究提供新的技术手段。