石斛碱对氧糖剥夺/再灌注诱导Ht22细胞损伤的神经保护作用及其机制研究

目的:探讨石斛碱(dendrobium alkaloids,DNLA)对氧糖剥夺/再灌注(oxygen glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)作用的Ht22海马神经元细胞系的神经保护作用及其机制。方法:体外培养Ht22细胞系,同时将细胞随机分为9组:无任何处理的正常对照组(Control组)、OGD/R组、OGD/R+DNLA治疗组(0.03 mg/mL)、OGD/R+DNLA治疗组(0.3 mg/mL)、OGD/R+DNLA治疗组(3 mg/mL)、OGD/R+焦亡相关蛋白Caspase-1的抑制剂VX765组(10 ng/mL)、OGD过程中培养基加入聚乙二醇PEG3000(1%)后再灌注组(OGD/R+PEG3000→Media)、OGD/R后培养基中加入PEG3000(1%)组(OGD/R+Media→PEG3000)、PEG3000(1%)组。对Ht22细胞OGD 2 h后复糖复氧24 h建立OGD/R模型;DNLA自OGD前12 h开始即加入并持续到复氧复糖结束;VX765则自氧糖剥夺开始即加入并持续到复糖复氧结束。MTT法检测细胞死亡率及乳酸脱氢酶法测定细胞损伤率,选取DNLA最佳剂量组(3 mg/mL)进行后续检测,流式细胞技术Annexin V FIFT/PI双染测细胞焦亡率,Western blot检测焦亡相关蛋白Caspase-1、GSDMD和GSDMD-C的表达以及白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6、IL-18的表达,免疫荧光染色法检测Ht22细胞Caspase-1的表达情况,扫描电镜观察Ht22细胞的焦亡情况。结果:在OGD/R诱导Ht22细胞损伤后通过扫描电镜观察到细胞焦亡现象,与Control组相比,OGD/R组细胞活性下降(P=0.008),细胞损伤率升高(P=0.009),细胞焦亡率升高(P=0.005),焦亡相关蛋白Caspase-1(P=0.000)、GSDMD(P=0.001)及GSDMD-C(P=0.004)蛋白的表达量明显升高,炎症因子IL-1β(P=0.006)、IL-6(P=0.004)、IL-18(P=0.000)的表达量亦增加,PEG3000组细胞存活率和损伤率均无明显变化(P=0.005,P=0.007);与OGD/R组相比,3个不同剂量的DNLA组细胞活性均有升高,细胞损伤率明显降低,细胞焦亡率递减,以DNLA组(3 mg/mL)最为明显(P=0.005,P=0.009,P=0.003),焦亡相关蛋白Caspase-1、GSDMD的蛋白表达量降低(P=0.005,P=0.008),GSDMD-C蛋白表达量升高(P=0.002),炎症因子IL-1β(P=0.005)、IL-6(P=0.000)、IL-18(P=0.007)的蛋白表达量降低,VX765抑制剂组的细胞存活率也有所上升(P=0.007),细胞损伤率降低(P=0.002),焦亡率也明显降低(P=0.008),焦亡相关蛋白Caspase-1(P=0.006)、GSDMD(P=0.007)蛋白的表达量有所降低,GSDMD-C蛋白的表达量升高(P=0.004),炎症因子IL-1β(P=0.006)、IL-6(P=0.004)、IL-18(P=0.001)的蛋白表达量亦降低,有趣的是OGD/R+PEG3000(1%)→Media组较OGD/R+Media→PEG3000(1%)组细胞存活率增加(P=0.007,P=0.006),损伤率下降(P=0.006,P=0.003)。结论:OGD/R作用后的Ht22细胞存在细胞焦亡现象,DNLA对OGD/R诱导的Ht22细胞损伤具有神经保护作用,其机制可能与抑制焦亡相关蛋白Caspase-1的表达有关。

白藜芦醇通过促进线粒体自噬减轻小鼠脑缺血/再灌注损伤的实验研究

目的研究白藜芦醇(resveratrol,Res)对脑缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤的保护作用及其可能作用机制。方法采用线栓法建立小鼠右侧大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型。各组小鼠术前连续腹腔给药5 d,每日1次。术后24 h对梗死体积和神经功能进行评价; Western blot检测沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)和线粒体自噬相关蛋白p62、LC3B、PHB2、TOM20表达情况,以及细胞色素C (cytochrome C,CytC)分布情况;流式细胞术检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)变化;酶标仪检测胞内ATP水平变化;透射电镜观察线粒体形态变化。结果Res预处理减少了脑梗死体积和神经功能缺损,提高了SIRT1和线粒体自噬相关蛋白表达,减少了CytC的释放,恢复了MMP,提高了ATP水平。透射电镜结果显示,Res减轻了缺血导致的线粒体损伤。自噬抑制剂3-MA抑制了线粒体自噬,同时也逆转了Res的神经、线粒体保护作用。结论Res减轻小鼠脑组织I/R损伤可能与其对线粒体自噬的调控,最终确保线粒体质量有关。

β-石竹烯通过上调miR-183的表达减轻小鼠缺血性中风损伤

目的探讨β-石竹烯(β-caryophyllene,BCP)是否对缺血性中风有保护作用,以及这种保护作用是否与miR-183和NF-κB的表达有关。方法在动物实验中,将90只C57BL/6雄性小鼠(20~25 g)编号后,根据随机数字法分为3组(n=30):假手术组、模型组、BCP(72 mg/kg)组。模型组和BCP(72 mg/kg)预处理组中动脉栓塞1 h后,再灌注24 h,构建小鼠缺血性中风模型。对小鼠进行神经行为学评分,TTC法测量小鼠脑梗死体积,HE染色和Nissl染色切片观察小鼠大脑神经元、炎性细胞和凋亡小体的病理变化,检测miR-183、NF-κB、p-NF-κB、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)的表达,双荧光素酶标记法检测miR-183与NF-κB的靶向关系。提取小鼠的原代神经元,分为3组:正常组、糖氧剥夺(oxygen-glucose deprivation,OGD)损伤组、BCP(10μmol/L)组。OGD损伤组与BCP(10μmol/L)预处理组神经元糖氧剥夺1 h后,正常培养24 h,构建神经元缺血性中风模型。观察神经元形态和数量的变化,测定细胞损伤率,测定神经元内miR-183、NF-κB和p-NF-κB的表达,检测炎性因子在神经元内的表达。结果动物实验中,与假手术组相比,模型组小鼠神经行为出现障碍,脑梗死体积增大(P<0.05)。脑组织切片HE染色和Nissl染色显示,缺血一侧的神经元等细胞受到严重损伤。同时,miR-183的表达下降(P<0.05),NF-κB被活化成p-NF-κB,炎性因子NF-κB、IL-1β和IL-6表达升高(P<0.05)。与模型组相比,BCP预处理能改善造模后小鼠神经行为障碍,减少脑梗死体积,保护神经元的形态,减少炎性细胞和凋亡小体的数量,增加皮质中的尼氏阳性细胞数量(P<0.05)。BCP预处理上调miR-183的表达,抑制NF-κB的活化,降低炎性因子的表达(P<0.05)。在神经元实验中,OGD后神经元受损严重,而BCP预处理则保护了神经元,降低神经元死亡率(P<0.05)。BCP预处理还上调神经元中miR-183的表达,抑制NF-κB的活化,降低神经元中炎性因子的表达(P<0.05)。结论缺血性中风后,BCP可能通过上调miR-183表达进一步抑制NF-κB的活化,减少炎性因子释放,从而减轻炎症,发挥脑保护作用。

β-石竹烯通过激活自噬减轻小鼠脑缺血/再灌注损伤的研究

脑缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤是急性缺血性脑卒中的重要诱因,而在脑缺血再灌注过程中通过调节自噬及时清除受损蛋白质和细胞器,对减轻脑损伤起着重要作用。该文为了探讨β-石竹烯(beta-caryophyllene,BCP)是否可以通过调节自噬对I/R损伤小鼠起到神经保护作用,将C57BL/6雄性小鼠随机分为假手术组、模型组、给药组,各组小鼠术前连续灌胃给药5 d后,采用线栓法建立小鼠右侧大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型。术后24 h对脑梗死体积和神经功能进行评价;HE染色法观察缺血区皮层组织病理改变;Western blot法检测自噬相关蛋白beclin1,p62,LC3B和凋亡相关蛋白Bcl-2的表达情况;免疫荧光法观察LC3B在缺血区皮层组织中的表达;透射电镜观察缺血区皮层组织细胞自噬现象。结果显示,与模型组相比,BCP预处理可明显减轻小鼠的神经功能缺损,降低脑梗死体积百分率,减少缺血区脑组织细胞的死亡,上调beclin1,LC3B,Bcl-2蛋白的表达,下调p62蛋白的表达,明显增加缺血区皮层组织自噬体的数量,最终确定BCP可以通过激活自噬对I/R损伤小鼠起到较好的神经保护作用。