尼罗罗非鱼Cullin-1基因克隆及表达

【目的】探究尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)Cullin-1(CUL1)基因在尼罗罗非鱼抵抗病原细菌过程中的作用。【方法】从尼罗罗非鱼脾脏组织中克隆Cullin-1基因(记为On-CUL1),对其进行生物信息学分析,应用实时荧光定量PCR技术分析On-CUL1在健康鱼胸腺、鳃、肝、脾、肠道、头肾、脑、肌肉、皮肤、血液组织,以及经无乳链球菌刺激后病鱼脾、肠道、头肾中的表达。【结果与结论】On-CUL1(GenBank登录号XM003459470.5)编码区为2 331 bp,编码776个氨基酸,理论分子质量为89 ku,理论等电点为8.16。氨基酸序列分析显示,On-CUL1有1个高度保守的泛素样蛋白结构域CUL1 Nedd8(ubiquitin-like domain),N′端有一个的信号肽序列。系统进化树分析表明,On-CUL1序列与伯氏拟丽鱼(Haplochromisburtoni)CUL1相似性最高,为98.7%。q RT-PCR显示CUL1在健康尼罗罗非鱼各组织中均有表达,其中在头肾中表达量最高,其次是胸腺、脑、皮肤,在肠道中表达量最低。经无乳链球菌刺激后,On-CUL1表达量在脾脏和肠道中均显著上调,头肾、脾脏和肠道均在48h表达量最大。CUL1参与尼罗罗非鱼抵抗无乳链球菌过程中的免疫应答。

尼罗罗非鱼Galectin-4基因的原核表达及诱导条件优化

【目的】研究尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)Galectin-4基因(记作OnGal-4)的原核表达,为大量获取尼罗罗非鱼Galectin-4蛋白(OnGal-4)和后续功能研究奠定基础。【方法】根据NCBI上公布的尼罗罗非鱼Galectin-4基因序列(Genbank:XM-019345120)设计引物,构建原核表达载体,诱导Galectin-4重组蛋白(r OnGal-4)在BL21原核表达系统中表达,并优化其诱导条件。【结果与结论】成功扩增出OnGal-4基因,并构建原核表达载体pGEX-4T-On Gal-4。rOnGal-4最佳诱导条件是温度28℃,IPTG浓度0.4 mmol/L,诱导时间4 h。在此条件下,rOnGal-4在可溶性蛋白中大量表达。Western-blot结果显示,rOnGal-4可与抗GST标签的单克隆抗体发生特异性反应。

尼罗罗非鱼的Galectin-8基因的原核表达及条件优化

Galectin-8属于S型凝集素,是一种内源性凝集素,具有高亲力,含β-半乳糖苷,可识别重要的病原分子[1]。该蛋白质有2个功能结构域,均提供该家族中其他蛋白质类似的保守序列[2]。该研究基于尼罗罗非鱼Galectin-8 NCBI上发表的基因序列,利用primer5.0设计1对引物,构建尼罗罗非鱼Galectin-8基因的原核表达载体,将重组后的质粒pGEX-4T-1-Galectin-8导入大肠杆菌中,通过PCR、连接、转化等,进行原核表达。对影响因素进行条件优化,使用优化后的浓度、时间、温度条件表达Galectin-8重组蛋白能得到最优表达量。Western blot检测纯化后的重组蛋白,结果显示,重组蛋白可以很好地结合GST-Tag标签的单克隆抗体,实验进一步证明罗非鱼Galectin-8的重组蛋白被成功表达,为罗非鱼Galectin-8后续相关功能的研究奠定了基础。