2.1亚型猪瘟病毒流行株E2蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

为获得仅与我国基因2.1亚型猪瘟病毒(CSFV)流行株反应的单克隆抗体(MAb),并揭示疫苗株与流行株E2蛋白抗原氨基酸的差异,本研究利用基因2.1亚型重组质粒p FastBac1-JL23 E2通过杆状病毒表达重组E2蛋白(rE2),并采用Ni柱纯化后经SDS-PAGE检测r E2的表达及纯化效果;采用western blot鉴定r E2的反应原性。SDS-PAGE及western blot结果表明经杆状病毒表达了基因2.1亚型CSFV E2蛋白,且其纯化效果和反应原性均较好。采用杂交瘤技术制备2.1基因亚型CSFV E2蛋白的单克隆抗体(MAb),采用亲和层析法纯化该MAb,采用BCA法测定其浓度及亚类。将79株1.1、2.1、2.2和2.3基因亚型的CSFV及1.1基因亚型的HCLV株和SM株感染PK-15细胞,72 h后采用IFA检测MAb与不同基因型CSFV的反应性;采用western blot鉴定MAb与10个基因亚型共18种CSFV代表株E2蛋白的反应性。采用IFA鉴定MAb与不同基因型CSFV的中和活性。结果显示,经IFA筛选后共获得16株分泌E2蛋白MAb的杂交瘤细胞株。其中仅一株MAb TCH061与所有2.1基因亚型(2.1a、2.1b、2.1c、2.1g、2.1h、2.1i、2.1j、2.1k、2.1l、2.1m、2.1n)CSFV感染的细胞反应后出现绿色荧光,与基因1.1亚型HCLV疫苗株和SM株以及其他基因型CSFV感染的细胞反应后均无绿色荧光;western blot结果显示,该MAb能够识别2.1基因亚型CSFV E2蛋白(2.1a、2.1b、2.1c、2.1g、2.1h、2.1i、2.1j),在90 ku处出现特异性条带,而与其他基因型CSFV E2蛋白均不反应。表明TCH061为2.1基因亚型CSFV E2蛋白特异性的MAb。MAb的纯化结果显示,在50 ku和25 ku处有明显条带,其浓度为1.70μg/μL且该MAb TCH061重链为Ig G2a,轻链为κ链。中和活性结果显示,TCH061对JL^(23)株(2.1b)、GDLF1株(2.1c)有一定的中和活性,但不能中和C株。分别以GD53株E^(24)个不同区域的截短蛋白为抗原通过western blot初步确定MAb识别抗原表位的区域。利用CLC Sequence Viewer比对与MAb反应的CSFV E2蛋白氨基酸序列的差异,通过SWISS-MODEL预测MAb抗原表位的关键氨基酸位点。利用杆状病毒表达CSFV JL^(23)株各位点突变后的E2蛋白,采用western blot鉴定各突变的E2蛋白与MAb TCH061的反应性。Western blot结果显示,TCH061的抗原表位位于E2蛋白的aa1~aa90,且其识别CSFV E2蛋白P^(20)不识别L^(20)的CSFV。通过SWISS-MODEL预测E2蛋白氨基酸序列的I18、G^(19)、P^(20)、L^(21)、G^(22)、A^(23)和E^(24)在空间上比较接近;MAb TCH061与JL^(23)株I18M突变的E2蛋白反应,与G^(19)K、P^(20)L和L^(21)P突变的E2蛋白均不反应,与G^(22)K突变的E2蛋白反应性较弱,与HCLV E2蛋白不反应,但与HCLV L^(20)P突变的E2蛋白反应。证实TCH061的抗原表位为^(19)GPLG^(22),经Py MOL结构模拟确定其为空间构象表位;且除了aa^(20),其他位点在各基因型CSFV中均非常保守,表明P^(20)是2.1基因亚型CSFV流行株E2蛋白抗原表位的关键氨基酸。综上所述,本研究首次获得一株区别于CSFV疫苗株和2.1基因亚型CSFV流行株的MAb TCH061,揭示了疫苗株与流行株E2蛋白氨基酸位点的差异,为研发猪瘟疫苗和CSFV流行株感染的血清学鉴别检测方法的建立提供了重要的MAb资源。

一株区分猪瘟病毒疫苗株和流行株的单克隆抗体的制备及其抗原表位鉴定

为制备可鉴别猪瘟病毒(CSFV)疫苗株(LPC)和流行株的单克隆抗体(MAb),并解析流行株逃逸宿主免疫血清中和抗体的机制,本研究利用猪瘟兔化弱毒疫苗株的E2蛋白免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞电融合,利用间接免疫荧光试验(IFA)筛选分泌抗CSFV E2蛋白MAb的杂交瘤细胞,利用IFA和western blot鉴定MAb与猪瘟兔化弱毒疫苗株及其不同基因型流行株或E2蛋白的反应原性以明确MAb的病毒反应谱。结果显示,本研究获得了一株仅与基因1.1和3.1亚型CSFV反应,但不与其他8个亚型流行株或E2蛋白反应的MAb TCH045,表明该MAb能够鉴别CSFV疫苗株和当前优势流行株。本实验进一步点突变E2蛋白后利用western blot对TCH045识别的抗原表位进行鉴定,结果显示,疫苗株E2蛋白的G^(19)、L^(21)、A^(23)、G^(24)和L^(26)突变后,TCH045与突变的E2蛋白不反应,表明这些氨基酸参与组成该MAb识别的抗原表位,其中G^(24)为关键氨基酸残基,而不与TCH045反应的流行株在该位点为E^(24)。此外,TCH045能够中和疫苗株(HCLV株和LPC株),但不能中和当前优势流行株,这可能是流行株逃逸免疫血清被中和的原因之一。综上所述,本研究获得了一株新的能区别CSFV疫苗株和流行株的中和MAb,可以用于疫苗免疫和流行株感染的血清学鉴别诊断技术的研发,初步揭示了CSFV流行株逃逸免疫血清中和的机制,为研发新型猪瘟疫苗提供了重要的科学数据。