抗CD20嵌合抗体片段Fab′突变体的表达和活性研究

利用PCR方法从抗CD2 0单链抗体 (ScFv)表达载体上扩增抗CD2 0抗体轻链可变区基因 (VL)、重链可变区基因 (VH) ,同时在抗体的可变区引入突变 ,然后将VH、VL 基因重组到Fab′表达载体pYZF1中 ,构建抗CD2 0嵌合抗体Fab′片段表达载体 ,并在大肠杆菌 16c9中进行高效可溶性分泌表达。经大量的筛选 ,获得一个产量和活性均有所提高的突变克隆。其突变位点在轻链可变区的CDR1区 ,即G77→A(Ser→Asn)。突变的抗体的表达量为每克干菌 3 8mg ,而未突变抗体的表达量为每克干菌 1.3mg。突变体的亲和力常数Ka为 2 .2× 10 9L mol,约为突变前的 2倍。竞争性免疫荧光抑制实验表明 ,突变的Fab′片段能竞争性抑制鼠源性抗CD2 0抗体HI4 7和CD2 0表达细胞Raji细胞的结合 ,使HI4 7的结合阳性率由 98%下降至 37.5 5 % 。

单价抗CD20抗体诱导人B细胞淋巴瘤Raji细胞的凋亡

背景与目的:抗CD20抗体和片段已应用于非霍奇金淋巴瘤的临床治疗,但仍需要开发新的抗CD20抗体和片段(未修饰的或放射性标记的),以治疗对美罗华(利妥昔单抗)无反应的患者。鼠源性抗CD20抗体HI47的嵌合抗体片段Fab和F(ab)'2已被构建。本研究目的是观察HI47(鼠抗-CD20抗体)和其嵌合抗CD20抗体片段抑制肿瘤细胞生长和诱导肿瘤细胞凋亡的作用。方法:用免疫荧光法测定抗CD20抗体与CD20+人B细胞淋巴瘤Raji细胞的结合能力;MTT法测定抗CD20抗体片段对Raji细胞生长的影响;用膜联蛋白Ⅴ染色和DNA琼脂糖凝胶电泳检测和验证抗CD20抗体片段诱导Raji细胞凋亡。结果:HI47和其嵌合的抗CD20抗体片段均可与CD20+Raji细胞结合,结合率可达90%以上;HI47不能与美罗华竞争结合Raji细胞;HI47和其嵌合的抗CD20抗体片段浓度为100μg/ml对Raji细胞的抑制率分别为:(57.0±1.5)%、(65.2±2.5)%、(77.2±3.2)%;单价的抗CD20抗体片段Fab(20μg/ml)能够诱导Raji细胞的凋亡,早期凋亡率为17%。结论:HI47的嵌合抗体片段对Raji细胞有抑制作用,能诱导Raji细胞的凋亡。

CD20分子与靶向治疗

CD2 0是B淋巴细胞上的跨膜蛋白质 ,分子量范围为 33～ 37kD ,以非糖基化的磷酸化蛋白质形式存在。CD2 0是调节B淋巴细胞生命与分化信号转导的重要分子 ,其在B细胞中特有的表达方式、生物学作用和存在形式决定了其成为治疗B淋巴细胞瘤的主要靶位点。研究CD2 0的生理作用有利于阐明抗CD2

恶性血液肿瘤的单克隆抗体靶向治疗

造血细胞表达谱系专一性抗原是单克隆抗体靶向治疗恶性血液肿瘤的理想靶点。基因工程技术的发展为降低单克隆抗体的免疫源性,加强单克隆抗体对肿瘤细胞的杀伤作用提供了有力的手段。针对CD20、CD52、CD33的工程抗体Rituximab、Campath—1H和Mylotary已应用于临床治疗,在低度滤泡性非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病和急性髓系白血病的治疗中取得了良好的效果。

嵌合抗CD_(20)抗体分子在CHO细胞中的表达

利用PCR方法从抗CD2 0 抗体Fab′片段的表达载体上扩增抗CD2 0 抗体的轻链和重链可变区 ,将轻链和重链可变区组装到含有人抗体恒定区的表达载体中 ,构建抗CD2 0抗体IgG的轻链和重链表达载体PK10 0VL和PGL0 5VH ,并用质脂体法共转染CHO细胞 ,RT PCR和ELISA检测结果证实了抗CD2 0 抗体IgG全分子在CHO细胞中的分泌表达。免疫结合结果表明CHO细胞分泌表达的抗CD2 0 抗体IgG全分子可与CD2 0 阳性的B淋巴瘤Raji细胞结合。

抗CD20嵌合抗体片段F(ab′)2突变体在大肠杆菌中的高效分泌表达

构建抗CD2 0嵌合抗体片段F(ab′) 2 突变体 ,研究其在大肠杆菌中的高效表达及其表达产物的生物学活性。采用PCR法构建抗CD2 0嵌合抗体片段F(ab′) 2 突变体 ,并用双脱氧终止法测定DNA序列 ;采用 19L发酵罐高密度发酵抗CD2 0嵌合抗体片段F(ab′) 2 突变体 ,采用亲和色谱和分子筛色谱法纯化表达产物 ,并用SDS PAGE和薄层激光扫描鉴定纯化产物 ;采用活细胞间接免疫荧光法测定纯化产物与靶细胞的结合活性 ;MTT法测定纯化产物对Raji细胞的生长抑制作用 ,并研究其作用机理。DNA序列测定结果表明 ,抗CD2 0嵌合抗体片段F(ab′) 2 突变体已成功构建 ,表达可溶性产物的产量达 36 0mg L ,具有与Raji细胞 (CD2 0 + )结合的活性 ,并抑制Raji细胞的生长 ,其作用机理为诱导Raji细胞凋亡。

抗CD3基因工程嵌合抗体IgG在哺乳动物细胞中的表达和活性测定

利用基因工程方法将鼠源性抗CD3抗体HIT3a的可变区和人源抗体 (IgG)的完整的恒定区连接起来 ,构建全抗型抗CD3嵌合抗体 ,该型抗体具有较低的免疫源性可作为免疫抑制剂应用于器官移植 ,减少受体产生免疫排斥 ,提高移植器官的存活率。利用PCR方法从抗CD3ScFv重组噬菌体表达载体pCANTAB 5E上扩增抗CD3抗体的轻链和重链可变区 ,将轻链和重链可变区组装到含有人抗体 (IgG)恒定区的表达载体中 ,构建抗CD3嵌合抗体IgG的轻链和重链表达载体PKN10 0和PG1D10 5 ,并用脂质体法共转染CHO细胞。结果证明 ,抗CD3嵌合抗体的VL 和VH 与HIT3a抗体的VL 和VH 完全相符 ,ELISA和Westernblot检测结果证实转染细胞的培养上清中含有抗CD3嵌合抗体IgG的表达 ,表达产物能与Jurkat细胞结合 ,并能竞争性抑制HIT3a抗体和Jurkat细胞结合活性 ,3H TdR掺入实验表明 ,抗CD3嵌合抗体与亲代抗体HIT3a一样 ,具有促进外周血单核细胞增殖的作用。我室构建的全抗型抗CD3嵌合抗体分子表达载体可在CHO细胞中稳定表达 ,表达产物有较好生物活性 。

嵌合抗CD20抗体Fab′片段诱导Raji细胞凋亡过程中活性氧自由基的变化

目的 研究嵌合抗CD2 0抗体Fab′片段对B淋巴细胞株Raji细胞活性氧自由基 (ROS)的影响。 方法 利用MTT法测定Fab′片段抑制细胞生长 ,形态学方法和DNA琼脂糖凝胶电泳法观察Fab′片段对细胞凋亡的影响 ,用DCFH DA和双氢罗丹明 1 2 3(DHR )标记细胞内活性氧(ROS)变化 ,并用流式细胞仪检测。结果 MTT法测定抗CD2 0抗体Fab′片段对Raji细胞的生长具有抑制作用 ,其抑制作用呈明显的剂量依赖性 ,电镜观察 ,可见“凋亡小体”出现 ,DNA电泳可见典型的“梯形”条带 ,抗CD2 0抗体Fab′片段能增加Raji细胞内ROS水平 ,且随浓度增加而增加。 结论 ROS水平升高在抗CD2

抗CD20嵌合抗体片段Fab′突变体对B淋巴细胞凋亡及胞内Ca^(2+)的影响

目的研究抗CD20嵌合抗体片段Fab′突变体诱导B淋巴细胞凋亡的发生、凋亡相关基因表达以及细胞内钙离子的浓度变化。方法以人B淋巴细胞(Raji细胞)为凋亡细胞模型,通过MTT法、Western blot和流式细胞仪等方法观察bcl-2/bax基因表达、细胞色素c及胞内Ca2+的变化。结果抗CD20嵌合抗体片段Fab′突变体对Raji细胞生长增殖具有明显的抑制作用,并呈剂量依赖性。细胞中bcl-2表达有微弱的下降,而bax表达明显升高,并出现细胞色素c的释放和胞内Ca2+浓度的升高。结论抗CD20嵌合抗体片段Fab′突变体诱导Raji细胞凋亡,与bcl-2/bax表达、细胞色素c的释放和胞内Ca2+浓度的升高有关。

嵌合抗CD20Fab′抗体片段诱导Raji细胞的凋亡机制

目的 :探讨嵌合抗CD2 0抗体Fab′片段的抗肿瘤机制。方法 :应用MTT法检测Fab′片段对Raji细胞生长的抑制作用 ,用AnnexinV FITC和PI测定Fab′片段对Raji细胞凋亡的诱导作用 ,用RT PCR和Westernblot检测Raji细胞中bcl 2表达的变化。结果 :嵌合抗CD2 0Fab′片段对Raji细胞具有明显的抑制作用IC5 0值为 2 4 .2 μg/ml,并呈剂量依赖性 ;嵌合抗CD2 0Fab′片段能诱导Raji细胞的凋亡 ,并降低Raji细胞中bcl 2基因及其蛋白的表达水平。结论 :嵌合抗CD2 0抗体片段Fab′能抑制Raji细胞生长和诱导细胞凋亡 ,其作用机制与bcl 2蛋白表达的下降有关。

不同压力等级医疗袜下腿部共偶变形分析

为探究不同压力等级下医疗袜对腿部共偶变形的影响,测量不同压力等级医疗袜的多个姿势中腿部各截面的共偶变形。结果表明:相比较1级压力医疗袜,2级和3级压力医疗袜对中腿部分的共偶变形作用大;在足底用力的情况下(微蹲、自然站立、踮脚站立),足与小腿间的角度为90°时,踝骨围最大;双脚均着地(自然站立、微蹲、正坐)时,膝围大小与大腿和小腿夹角呈负相关,夹角越小,膝围越大。研究结果可为产品设计师和医师在开发和临床应用医疗袜方面提供参考。

抗CD20嵌合抗体突变型Fab′片断诱导凋亡过程中活性氧Caspase-3的变化

目的研究抗CD20嵌合抗体突变型Fab′片断诱导Raji细胞凋亡过程中活性氧(ROS),Caspase3的变化。方法利用MTT法测定突变型Fab′片断抑制细胞生长,形态学方法观察凋亡细胞的变化,用流式细胞仪检测DCFHDA荧光探针标记细胞内ROS的变化,以及用酶标仪和Westernblot检测细胞内Caspase3的变化。结果MTT法测定突变型Fab′片断对Raji细胞的生长具有抑制作用,其抑制作用呈明显的剂量依赖性,荧光显微镜下观察细胞出现凋亡,流式细胞仪,酶标仪以及Westernblot检测细胞内ROS,Caspase3的表达增高,并与作用时间,剂量呈依赖关系。结论ROS,Caspase3表达的增高,在抗CD20嵌合抗体突变型Fab′片断诱导Raji细胞凋亡的过程中起到重要作用。

如何让语文课走出尴尬展现其应有的美

新课标实施十几年来，语文课遭遇了不少的尴尬。如何让语文课展现其应有的美呢？该文从一节课的开场、课堂的朗读、课堂的探讨、老师对学生的肯定用语等方面探讨了让语文课展现其应有的关的看法。

沙浴消解法测定水中总铬

对高锰酸钾氧化—二苯碳酰二肼分光光度法测定总铬中的氧化过程进行改进,采用沙浴加热氧化,即于50mL比色管中取样加入0.5mL(1+1)硫酸、0.5mL(1+1)磷酸、2滴4%高锰酸钾氧化剂,于沙浴中加热氧化、冷却、定容、显色、比色测定。结果表明,此方法操作简便,耗时较短,测定结果准确度、精密度高,有一定可行性。

突发事件行动审计思考

突发事件行动审计是特殊环境下的审计项目,有其自身的特殊性。本文通过对突发事件行动审计的存在问题及其原因的分析,提出了改进突发事件行动审计的具体措施,以期对审计理论的完善与发展有所帮助。

狂犬病病毒滴度直接免疫荧光检测法的建立及验证

目的建立狂犬病病毒滴度的直接免疫荧光检测法,并进行验证。方法将狂犬病病毒Pitman-Moore株(PM株)病毒液进行5倍系列稀释后,感染MRC-5细胞,37℃培养24~30 h;用FITC标记的抗狂犬病病毒特异性抗体进行染色,通过计数病毒感染细胞的荧光灶数计算病毒滴度,并验证方法的重复性、中间精密度及线性范围。采用小鼠脑内滴定法及建立的直接免疫荧光法同时检测20批PM株病毒液,并分析两者间的相关性。结果重复性及中间精密度验证结果的变异系数(CV)均﹤2%;病毒稀释倍数在5^(0)~5^(-7)范围内,与病毒滴度呈良好的线性关系,线性回归方程为Y=-0.7392 X+8.031,R^(2)=0.9866。两种方法检测结果趋势相同(R-Square=0.905),呈良好的正相关性。结论本实验建立了狂犬病病毒滴度的直接免疫荧光检测法,且具有良好的重复性及中间精密度,可应用于狂犬病疫苗生产过程中的质量控制。

关注“110”资产

随着深化农村信用社改革试点工作的全面实施和改革进程的加快,人民银行向农村信用社定向发行的用以置换农信社不良贷款的票据逐步到位,农信社形成了大量表外信贷资产,在表外110科目反映,即央行专项票据置换不良贷款(简称“110”资产)。近期,笔者对农信社的“110”资产管理情况进行了调查。

湖南:改革步入快车道

本刊讯通讯员刘银星报道11月4日,湖南省深化农村信用社改革试点工作会议在长沙召开。会议根据国务院深化农村信用社改革试点工作会议精神,结合实际,对该省农信社改革试点工作作了动员和部署,改革工作步入快车道。湖南省委副书记、常务副省长于幼军到会并作了重要讲话。