表皮角质分化过程中的信号转导

表皮是人体的第一道防护屏障,对维持机体内环境的稳定起到了巨大的作用。表皮是新陈代谢频率较快的组织,正常机体中表皮的增殖、分化和凋亡处于一种动态的平衡中,一旦这种平衡失调,将会导致严重的皮肤病,因此,机体内应有一套精密的调控系统来调控这一过程。Notch、TGF-β和钙离子等信号通路可能参与了表皮的分化。

硅纳米颗粒的生物毒理学研究

目的:研究硅颗粒制成纳米颗粒后的长期毒性及生殖毒性。方法:将硅纳米颗粒经尾静脉注入小白鼠体内,收集尿液离心后,电镜下观察是否有纳米颗粒的存在,并将小白鼠雌雄合笼交配产生后代,观察其产仔率,同时在电镜下观察纳米颗粒在亲代鼠各脏器中的分布。结果:硅纳米颗粒进入小鼠体内后,分布于小鼠各脏器,并能经肾脏排泄,同时注入纳米颗粒的小鼠能正常的繁殖后代。结论:硅纳米颗粒没有毒性并能在体内使用。

人源基因载体pHrn介导p53基因在Bel-7402中的抗癌研究(英文)

利用人源基因载体结合人巨细胞病毒(CMV)增强子,人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)启动子及肿瘤抑制基因p53构建肿瘤抑制载体,研究它们在肝癌细胞株Bel-7402中的功能.将CMV增强子(CMVe)与肿瘤特异性启动子hTERTp组合,分别结合GFP及精氨酸型和脯氨酸型肿瘤抑制基因p53,构建GFP表达载体pchEGFP以及p53表达载体pchp53Arg和pchp53Pro;脂质体2000转染肝癌细胞株Bel-7402;24h后利用荧光显微镜以及流式细胞仪检测GFP的表达;RT-PCR、蛋白质印迹检测p53基因的表达;利用Hoechst33258、Annexin V/PI染色,检测p53促使肿瘤细胞的促凋亡情况.结果表明:GFP荧光表达载体在Bel-7402细胞中能有效表达;RT-PCR及蛋白质印迹检测到精氨酸型和脯氨酸型p53基因在Bel-7402细胞内表达;Hoechst33258染色及Annexin V/PI染色检测细胞凋亡实验没有得到明显的细胞凋亡结果.结果表明:实验所构建的肿瘤抑制载体在肝癌细胞Bel-7402能有表达,并能形成外源性p53蛋白,但没有检测到明显的p53促使肝癌细胞调亡的结果.这可能与p53对hTERT的负调控作用有关.

人核糖体DNA打靶载体介导mda-7基因对肝癌的体外基因治疗研究(英文)

人核糖体DNA打靶载体pHr是一种由中南大学医学遗传学国家重点实验室开发构建的针对人类基因组的同源重组质粒载体.利用pHr构建了一种mda-7/GFP融合基因的人源基因表达载体pHr-CMG,并研究了其在肝癌细胞系Bel-7402中的作用.利用荧光显微镜、RT-PCR和Western blotting检测了mda-7/GFP融合基因的表达;利用细胞周期分析、MTT和Hoechst33258染色研究了其在细胞中的作用.结果显示,pHr-CMG载体能在Bel-7402细胞中有效表达MDA-7/GFP融合蛋白,进而抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡,推测其可能是由载体表达了mda-7基因引起细胞在G2/M期累积所导致的.同时,实验结果证实了人核糖体DNA打靶载体系统以及pHr-CMG表达载体的有效性,为其在进一步基因治疗研究中的应用提供了理论和实验基础.

真核细胞中多重表达框mRNA的选择性翻译起始(英文)

扫描模型和遗漏扫描模型是真核生物m RNA翻译起始的两种主要机制,但其仍存在某些例外情况,如对具有多顺反子结构的m RNA,选择性翻译起始的发生机制目前仍不清楚.本研究基于GFP蛋白开放表达框(ORF)构建了一系列重组表达载体,用以转录在移码翻译顺序及同一翻译顺序下,AUG起始密码子处于不同序列背景,以及间隔不同距离的多顺反子结构m RNA.通过转染人Bel-7402细胞系,研究了这些多顺反子结构m RNA的翻译起始模式.结果表明,在移码翻译顺序下,多顺反子m RNA可翻译出对应的不同蛋白质,而在同一翻译顺序下,GFP蛋白表达框中的多个AUG密码子,仅有首位起始密码子可发挥作用,提示核糖体在从首位起始密码子开始翻译的同时,可能会有部分核糖体继续向下扫描并识别下游的起始密码子,而这种选择性的翻译起始效率,主要取决于密码子所处的序列背景及间隔距离等因素.

血友病A的基因治疗

血友病A是一种X-连锁隐性遗传病,在男性中的发病率约为(1～2)/10000。血友病A的临床症状主要是自发性关节、软组织或其他组织的出血、血肿,常可致残,甚至危及生命。其致病机制是由于编码凝血因子Ⅷ的基因先天性异常而导致的凝血因子Ⅷ缺乏或功能缺陷。血友病A是基因治疗的首选疾病之一。本文就血友病A基因治疗中所采用的载体和靶细胞作一综述。

核定位信号肽提高核糖体区打靶载体转染效率的研究(英文)

核糖体区打靶载体(10～14kb)是中南大学医学遗传学国家重点实验室构建的一种具有定点整合能力的非病毒载体,具有安全性好及长期稳定表达的特点,但是较低的转染率成为其应用于临床的主要障碍.核定位信号肽可以促进非病毒载体进入细胞核,从而提高其转染效率.但是核定位信号肽提高外源基因表达的能力却严重受到其与DNA偶联方式及偶联剂的影响.采用偶联剂SPB可以通过静电作用将核糖体区打靶载体与SV40核定位信号肽有效结合,并且可以防止其被DNase降解.应用聚乙烯亚胺转染人原代皮肤成纤维细胞后,激光共聚焦显微镜观察显示,核定位信号肽可以在60min内携带12kb的质粒DNA进入细胞核.转染后48h,流式细胞仪检测GFP表达,结果显示转染率提高了4～5倍.聚乙烯亚胺是一种毒性小,而且价格低廉的高分子转染试剂,广泛被应用于体内基因治疗的研究中,上述研究将会促进核糖体区打靶载体在临床基因治疗中的应用.

间充质干细胞在肿瘤治疗中的应用

间充质干细胞(mesenchyal stem cells,MSCs)是一种广泛存在于人体内的具有自我更新及多向分化潜能的多能干细胞。由于其具有肿瘤组织趋向性、易于工程化操作等优势,近年来已被广泛应用于肿瘤治疗研究。但MSCs的促瘤或抑瘤效果颇具争议,尤其对于未修饰的MSCs。因此,研究者们更倾向于以MSCs为载体,对其进行工程化修饰。随着对囊泡认识的深入,发现以MSCs来源的囊泡作为载体更具优势。目前,MSCs在肿瘤治疗中的研究已经进入临床,但其在临床应用之前仍有许多问题需要解决。

胎膜来源的间充质干细胞促进烧伤愈合的研究

目的:研究胎膜来源的间充质干细胞在治疗SD大鼠Ⅲ度烧伤中的作用。方法:用胰酶消化法分离足月产胎膜细胞,加入Amino-MAXⅡ培养基进行培养。流式细胞仪检测细胞表面标志物CD29、CD73、CD14、CD45。分别用浓度为3mg/ml、5mg/ml、7mg/ml、9mg/ml的明胶溶液包被脱细胞真皮(ADM),以5×106/ml的密度将细胞种植在包被和未包被的ADM表面,2小时后收集未贴附在ADM上的细胞,计算细胞种植效率。实验组:以7mg/ml的明胶包被ADM,以5×106/ml的密度种植第2～3代细胞,培养3～5天后,移植至SD大鼠Ⅲ度烧伤创面;对照组Ⅰ移植单纯的ADM,对照组Ⅱ未进行移植,术后定期观察创面大体情况,计算创面收缩率、表皮再生面积比例,第5周切取新生皮肤组织行HE染色。结果:胎膜分离的细胞以长梭形为主,表达与间充质干细胞相关的表面抗原标志物CD29、CD73,极少表达造血细胞标志物CD14、CD45。不同浓度明胶溶液包被和未包被的ADM,其细胞种植效率均无明显区别(P>0.05);相比对照组,实验组移植物成活时间更长,创面再上皮化时间较早,创面收缩率较小,再生表皮面积亦较多(P<0.05);再生表皮更厚,有明显的表皮突,真皮层毛细血管丰富。结论:成功分离、培养了胎膜来源的间充质干细胞。胎膜来源间充质干细胞复合ADM可促进SD大鼠Ⅲ烧伤创面表皮再生,加速创伤愈合,抑制创面收缩。

利用核糖体基因区打靶载体靶向表达改造型人凝血因子Ⅷ

构建了携带改造型hFⅧ(hFⅧ-BDDAK39)的核糖体基因区靶向表达载体pHrneo-BDDAK39,并将其转入人纤维肉瘤细胞(HT1080),检测其定点整合的能力及hFⅧ-BDDAK39的表达情况.结果显示,pHrneo-BDDAK39能够成功地将hFⅧ-BDDAK39靶入到HT1080细胞的核糖体基因区,定点整合效率达到2.0×10^(-5),并且靶入的hFⅧ-BDDAK39能有效表达,表达量为(32±5)ng·10~6细胞^-1·24h^(-1).这为利用此靶向表达载体进行血友病A的基因治疗提供了重要的实验依据.

特异性核糖体基因区打靶载体介导CDUPRT治疗肝癌的体内外研究

核糖体基因区打靶载体pHrn是本室构建的人源基因载体之一，为探讨其在肝癌基因治疗的作用，本研究构建了pHr—CeTpCDUPRT／GFP质粒载体并进行了肝癌的体内外治疗实验研究．该质粒载体以pHrn载体为骨架，CMV＋hTERT启动子作为转录调控元件，CDUPRT／GFP自杀融合基因为目的基因．体外转染肝癌细胞BEL7402后，流式细胞仪检测转染效率为30％～50％；RT—PCR和Western blotting结果表明，有CDUPRT表达；HPLC检测5-FC可转化为5-Fu，给药后12 h 5-Fu浓度达60．15μg／mL；四唑盐（Methylthiazolyl tetrazolium，MTT）分析结果显示，200～800μg／mL5-FC使BEL7402的平均存活率为60％～35％．同时，对裸鼠肝癌模型进行瘤内转染，结果显示，当持续注射质粒和前体药物治疗时，裸鼠肿瘤生长明显被抑制，甚至体积稍有缩小；RT—PCR检测结果表明，瘤内有CDUPRT表达；HPLC检测裸鼠血清中的5-FU浓度为7．694μg／mL；肿瘤组织病理切片显示，大量肿瘤细胞坏死．这些结果为实际应用此载体进行肝癌基因治疗提供了重要的实验依据．

以人皮肤成纤维细胞作为饲养层细胞培养人胚胎干细胞

目的:比较人皮肤成纤维细胞(human dermal fibroblasts,HDFs)与小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblasts,MEFs)的增殖能力及研究人皮肤成纤维细胞作为饲养层支持人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)未分化生长的能力。方法:利用组织贴壁法从人皮肤中分离出HDFs,通过细胞形态的观察和生长曲线的绘制比较HDFs与MEFs的体外增殖能力。将HDFs作为饲养层细胞与hESCs共培养,传代12代后,检测hESCs碱性磷酸酶(AKP)、表面特异性标志及胚胎干细胞特异性转录因子。结果:HDFs可连续传代培养15代以上,10代以下的HDFs增殖迅速,而MEFs自第4代起,增殖能力就明显下降;hESCs在HDFs饲养层上可传代培养12代以上,克隆边界清晰,细胞排列紧密,碱性磷酸酶、表面标志物检测均呈阳性,表达了hESCs特异性转录因子。结论:HDFs比MEFs具有更强的增殖能力;HDFs可作为培养hESCs的饲养层细胞。

核糖体基因区打靶载体电转染肝细胞的孵育条件的优化

目的:提高核糖体基因区打靶载体的转染效率,优化其电转染肝细胞的孵育条件。方法:在其它电转染参数一致的前提下,设计了6组不同的孵育条件,通过分析转染后细胞活率以及48h后目的基因GFP的表达效率,来比较多组不同的孵育条件对电转染效率的影响。结果:6组条件中,转染前21℃,1min,转染后21℃,1min孵育,得到的转染效率最优,比其它的条件得到的转染效率高50%。结论:孵育条件的优化能提高为核糖体基因区靶向表达载体在体外电转染肝细胞的转染效率。