早幼粒细胞白血病蛋白与TAK1结合蛋白相互作用的生物信息学分析与验证

目的通过生物信息学方法预测早幼粒细胞白血病蛋白与TAK1结合蛋白的相互作用,并通过免疫共沉淀方法进行实验验证。方法使用Rosetta软件,采用比较建模的方法,构建TAB1蛋白的三维模型;在PDB数据库中检索PML蛋白二级结构,并解析其晶体结构和三维结构。Zdock3.0.2软件进行PML与TAB1的蛋白-蛋白对接,并提取最佳构象进行对接模型的分子结构分析。α-MMC处理的M1炎性巨噬细胞,利用免疫共沉淀技术检测两种蛋白的相互作用。结果以PML的6IMQ为对接部位时,PML蛋白与TAB1蛋白能形成3个盐桥、6个氢键和6个疏水作用;以PML的5YUF为对接部位时,PML蛋白与TAB1蛋白能形成1个氢键、3个静电相互作用和9个疏水作用,两种对接模式皆能形成良好的分子对接和相互作用;在α-MMC处理4h后,其PML-IP组的细胞裂解沉淀液中分别能检测到显著的PML和TAB1阳性蛋白条带。结论PML蛋白与TAB1蛋白能发生较强的相互作用。

不同灸法艾灸血清对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞的影响

目的探讨不同灸法艾灸血清对类风湿关节炎(RA)滑膜成纤维细胞的影响,揭示不同艾灸方法对实验性RA抗炎效应的作用机制。方法用直接灸、温和灸、隔姜灸三种不同艾灸方法刺激实验性RA大鼠"肾俞"、"足三里"穴,收集血清,用艾灸血清作用于大鼠RA滑膜成纤维细胞,倒置显微镜观察各细胞形态。结果不同灸法"艾灸血清"培养RA模型大鼠膝关节滑膜成纤维细胞48h后,RA滑膜成纤维细胞状态变好,其形态逐渐接近于正常滑膜成纤维细胞,其中以隔姜灸组最为明显。结论艾灸治疗有改善病理性炎性滑膜成纤维细胞生长状态,可起到促进其向正常化转归的作用,不同灸法中以隔姜灸法治疗效果最为明显。

槐定碱抗病毒作用的研究进展

槐定碱(sophoridine,SRI)主要是从豆科槐属植物中提取的喹诺里西啶生物碱,是苦豆子、苦参和白刺花的主要活性成分之一。现代研究发现SRI具有广泛的药理活性,包括抗肿瘤、抗炎、抗心律失常、抗病毒和镇痛等。近年来,SRI的抗病毒作用受到学者们的关注,迄今尚未见其抗病毒作用及机制的详细总结。由此,该文通过查阅和梳理近15年来关于SRI抗病毒的国内外文献报道,对SRI抗柯萨奇病毒、呼吸道合胞病毒、乙型肝炎病毒、肠道病毒71等的抗病毒作用及机制进行归纳和总结,发现SRI对RNA和DNA病毒均具有良好抑制作用,能通过干扰病毒吸附、RNA复制、调节细胞因子及代谢产物发挥作用。同时,对SRI结构类似物的抗病毒机制研究进行了一定总结,提示SRI抗病毒作用的潜在机制尚可能与抑制病毒复制、提高免疫功能、抗氧化及抗炎等路径有关。该综述为SRI抗病毒方面的深入研究及临床应用提供了一定参考。

Mre11多克隆抗体的制备及初步鉴定

目的原核表达人Mre11蛋白,并制备出Mre11蛋白的多克隆抗体,为研究Mre11蛋白功能奠定基础。方法以人cDNA文库为模板,构建出原核表达质粒PET41a-Mre11,然后转化受体菌E.coli BL21,再经IPTG诱导表达,通过采用GST亲和纯化获得GST-融合蛋白,将该融合蛋白免疫兔以制备出Mre11多抗血清,最后采用western-blot及免疫荧光等方法检测其在细胞中的特异性。结果在受体菌E.coli BL21中成功诱导表达出了GST-Mre11融合蛋白,免疫新西兰大白兔后获得了高效价的Mre11蛋白抗血清,IP、western-blot及免疫荧光等多种方法检测证实该抗血清能够特异性识别293T和U2OS细胞株中Mre11蛋白,并能够正确清楚检测293T和U2OS细胞株中的Mre11表达情况,具有良好的特异性和高效性。结论成功制备出了兔抗人Mre11蛋白的多克隆抗体,为深入研究Mre11蛋白在DNA损伤中的功能奠定了基础。

路邓葡萄球菌单宁酶基因的克隆、表达、纯化与改造

为提高路邓葡萄球菌(Staphylococcus lugdunensis)单宁酶(Sl-tan)的活性,该文利用化学合成方法获得Sltan基因,将该基因连接到重组表达质粒pET43.1-A,再转化到大肠杆菌感受态细胞BL21-DE3中进行表达,通过亲和层析柱纯化,以没食子酸甲酯为底物进行酶活性测定以及酶学性质分析,并基于生物信息学分析,结合定点突变技术对Sl-tan进行人工改造。结果显示,获得的重组单宁酶产量明显增高,最高可达42 mg/L发酵液;酶学性质研究显示该酶在pH 8.0,温度40℃时获得的活性最高(40 U/mg);Ala460突变为Pro460后的Sl-tan活性可提高82.5%。

α-苦瓜素对巨噬细胞炎性细胞因子风暴的选择性抑制作用

目的α-苦瓜素(α-momorcharin,α-MMC)能受体依赖性靶向作用于单核细胞,调节其细胞因子表达而发挥免疫调节作用,但对巨噬细胞是否具有选择性调节作用尚不清楚。本实验通过细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的M1型炎性巨噬细胞模型,观察α-MMC对其炎性细胞因子风暴的抑制作用,并探讨其可能的靶向作用机制。方法Western blot法检测WIL2-S B淋巴细胞、H9 T淋巴细胞、THP-1单核细胞和M0巨噬细胞LRP1受体蛋白表达;CCK-8法检测4种细胞的生存率;ELISA检测M1巨噬细胞炎性细胞因子的表达水平;Western blot法检测M1巨噬细胞TLR4信号通路相关蛋白的表达。结果巨噬细胞具有与单核细胞一致的高密度LRP1受体;α-MMC在4个细胞上的存活率与该受体的密度呈正相关;α-MMC以剂量和时间依赖性抑制M1巨噬细胞的炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、MIP-1α和MCP-1表达;α-MMC对TLR4信号通路的TAK1/p-TAK1、p-JNK、p-AP1和p-p65信号蛋白有明显的抑制作用,这种抑制作用能被LRP1受体阻断剂阻断。结论α-MMC通过LRP1受体介导,抑制TLR4信号通路的TAK1,进而抑制下游NF-κB和MAPK通路,从而选择性抑制巨噬细胞炎性细胞因子表达。α-MMC对巨噬细胞的选择性免疫抑制作用可能使其成为治疗急性感染巨噬细胞激活综合征(macrophage activation syndrome,MAS)的非常有前途的药物。

艾灸血清对实验性RA大鼠滑膜成纤维细胞体外增殖及TRAF6表达的影响

目的研究两种艾灸血清对实验性类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)大鼠滑膜成纤维细胞体外增殖及滑膜成纤维细胞肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)表达的影响,探究艾灸血清对实验性RA大鼠抗炎效应的作用机制。方法将36只SD大鼠随机分为3组,即模型组、直接灸组、隔姜灸组,每组12只,每组大鼠制备RA模型。造模成功后,模型组不予以任何治疗,直接灸组、隔姜灸组分别给予直接灸法、隔姜灸法刺激RA模型大鼠的"肾俞"、"足三里"。疗程结束后,取腹主动脉血并离心取血清,用含有各组血清培养基培养RA模型滑膜成纤维细胞48 h,用Ed U试剂盒检测各组血清培养的滑膜成纤维细胞增殖情况并用Western blot检测培养48 h时各组细胞TRAF6的表达量。结果艾灸血清培养的RA滑膜成纤维细胞的增殖与模型组血清培养的RA滑膜成纤维细胞相比,细胞体外增殖受到抑制,细胞TRAF6表达量明显下降,以隔姜灸效果更为显著。结论艾灸血清可能通过抑制细胞TRAF6表达从而抑制RA滑膜成纤维细胞的增殖,发挥其抗炎作用。

基于科研素养培养的《食品毒理学实验》教学实践

科研素养是食品质量与安全专业学生能力培养的核心,但医学院校食品专业本科生课程中,《食品毒理学实验》注重的是食品毒性学安全性评价基本技能的训练,较少涉及科研思维和科研能力的培养。为提高成都医学院食品质量与安全专业本科学生的科研素养,结合学生的主观诉求,近年来在《食品毒理学实验》教学中借助教学改革,成功提高了学生的学习主动性和积极性,培养了学生的科学素养,取得了良好的教学效果。

千金藤素体外抗HSV-1的作用及机制初步研究

目的建立体外细胞病毒感染模型,基于细胞自噬探讨千金藤素抗HSV-1病毒感染的作用及其机制。方法用不同浓度(0.75,1.5,3 mg·L^-1)的千金藤素作用于感染HSV-1的Vero及Hela细胞,采用空斑实验法检测细胞的病变效应;采用Western印迹法检测病毒蛋白gB、gD及自噬信号通路相关蛋白TBK1,p62,LC3的表达水平;用透射电镜检测自噬泡的形成;采用工具药氯喹体外干扰自噬的发生。结果病毒对照组空斑形成数及病毒蛋白gB、gD的表达明显高于细胞对照组,其自噬相关蛋白LC3在4~12 h表达明显升高,12~48 h表达逐渐降低。与病毒对照组相比,千金藤素能明显降低空斑的形成及gB、gD的表达,且呈剂量依赖性,其半数中毒浓度TC50为5.4 mg·L^-1,半数抑制浓度IC50为0.835 mg·L^-1,治疗指数TI为6.47,表明千金藤素具有体外抗HSV-1的作用;进一步实验结果显示,高、中剂量组千金藤素能持续促进自噬蛋白LC3的表达及自噬泡的形成,同时能增加TBK1及P62蛋白的磷酸化水平;氯喹阻断自噬后,千金藤素对HSV-1毒性蛋白gB、gD的抑制能力明显降低。结论千金藤素能通过激活细胞自噬发挥体外抗HSV-1病毒作用,与其TBK1的激活密切相关。

基于网络药理学探讨香叶醇抑制结肠癌的作用机制研究

目的基于网络药理学和分子对接技术研究香叶醇抑制结肠癌的作用机制。方法通过PubChem获得香叶醇的2D、3D结构图,通过Swiss Target Prediction平台获得香叶醇单体对应的靶点信息,通过GeneCards数据库、OMIM数据库、TTD数据库获得与结肠癌相关的疾病靶点,并通过基因芯片数据平台(GEO)数据库,分析基因芯片,得到结肠癌的差异基因,通过Cytoscape3.8.2软件构建网络分析图,利用Metascape对交集基因进行基因本体论(GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路分析,通过分子对接结合文献验证。结果香叶醇对应的靶点基因有111个,GEO数据库与公共数据库交集基因396个,香叶醇与结肠癌交集基因18个;其中表皮生长因子受体(EGFR)、丝裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)、丝裂原活化蛋白激酶激酶1(MAP2K1)、MAPK14、雄激素受体(AR)、酪氨酸蛋白激酶JAK2、孕酮受体(PGR)、G2/有丝分裂特异性细胞周期蛋白B1(CCNB1)为关键靶点,主要涉及Janus激酶/信号转导和转录激活因子(JAK/STAT)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)等癌症相关信号通路及跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号转导、各种蛋白的磷酸化、细胞增殖等生物过程,通过蛋白激酶活性、核受体活性、激素结合等分子功能发挥作用,并且与病毒感染、胰腺癌、乙型肝炎、前列腺癌、肝细胞癌、非小细胞肺癌等疾病相关。结论该方法初步揭示了香叶醇抑制结肠癌的潜在靶点,为中药治疗结肠癌提供理论依据。