有机磷降解酶的固定化及其工业化应用初探

采用一种新型的酶固定化方法，在大孔微球中对有机磷降解酶（OPHC2）固定化，制备固相载体化的交联酶聚集体固定化酶。对具有实际应用意义的参数：热稳定性、牢固度和连续反应批次进行了重点研究。结果表明，有机磷降解酶固定化酶的半衰期在70℃时比游离酶提高了2．1倍。固定化酶分别在37℃的摇床中经14h高速振荡，以及在pH8、37℃条件下循环反应49个批次降解甲基对硫磷后，均未发现固定化酶酶活力下降。在37℃，有机磷降解酶固定化酶柱以每小时3倍柱床体积的速率对甲基对硫磷农药乳油的稀释液（甲基对硫磷含量为216mg／L）进行降解处理，系统连续工作156h，甲基对硫磷的降解率保持在98．4％～99．9％。

甲基对硫磷水解酶OPHC2的序列分析及结构预测

将氨基酸的多序列局部比对、基于结构的序列比对和氨基酸替换忍耐性分析等方法联合起来对甲基对硫磷水解酶OPHC2进行了序列分析,确定出4组保守性功能序列。根据其高级结构发现这类酶具有典型的α/β(TIM)折叠桶结构,由8个折叠结构构成活性中心区域,并且这4组保守序列都位于这8个折叠结构上。通过对这4组保守序列的进一步分析发现当一个序列中同时含有它们时,这个序列为甲基对硫磷水解酶的可能性大于60%。

Pseudomonas sp.1-7中甲基对硫磷水解酶基因的克隆及酶学性质研究

为了研究和分离有机磷降解酶及其编码基因,从农药厂污水处理池的活性污泥中分离出一株可以高效降解甲基对硫磷的细菌1-7,经16S rDNA鉴定为假单胞菌Pseudomonas sp.。通过构建基因组文库的方法克隆了1-7的甲基对硫磷水解酶基因ophc3,该基因全长为975 bp,编码324个氨基酸,其中前24个氨基酸残基可能为信号肽序列。将其在大肠杆菌中表达,并对重组甲基对硫磷水解酶(OPHC3)进行纯化和酶学性质的研究结果表明,其酶促反应最适pH值为8.0,在pH 6.0～10.0的范围内放置30 min酶的相对活性均在70%以上;最适反应温度为45℃,但该酶不耐高温,60℃下保温10 min,相对活性降至46.77%。

立体分子伴侣-脂肪酶特异折叠酶

细菌脂肪酶是一类重要的工业用酶,尤其以来源于假单孢杆菌Pseudomonas与伯克霍尔德菌Burk-holderia的脂肪酶应用最为广泛。然而,这类脂肪酶折叠过程中存在一个巨大的能障而无法自发正确折叠。研究发现,这类脂肪酶的编码基因所在操纵子中往往存在一个与其折叠相关的基因,编码一种脂肪酶特异折叠酶。该类蛋白为脂肪酶的立体分子伴侣,可与脂肪酶的折叠中间体相互作用,帮助脂肪酶越过折叠过程中的能量障碍,为其获得正确构象提供必要的空间信息。详细阐述了脂肪酶特异折叠酶的发现、分类、作用机制与应用前景。

来源于苍白杆菌的甲基对硫磷水解酶基因的克隆

有机磷化合物作为一类高效广谱的杀虫剂被广泛使用,在使用的同时也造成了大面积的环境污染。本研究从被农药高度污染的土壤中筛选到了一株对甲基对硫磷农药有高效降解能力的细菌,通过16S rDNA鉴定为苍白杆菌(Ochrobactrum sp.)。克隆该菌的有机磷降解酶编码基因mphxw,构建原核表达载体,其表达产物具有正常生物学活性,同时纯化了重组酶。

有机磷污染土壤和活性泥中有机磷降解酶基因和微生物多样性研究

采用珠磨法直接从受有机磷污染的土壤和活性泥样品中提取和纯化宏基因组DNA。根据有机磷降解酶基因保守区设计引物,从宏基因组中扩增有机磷降解酶基因片段。回收扩增产物后,构建了以pEASY-T3为载体的有机磷降解酶基因片段文库。从文库中随机挑选克隆进行DNA序列测定,并分析测序结果,评价有机磷污染土壤和活性泥中有机磷降解酶基因的多样性和新颖性。结果显示,88%土壤来源序列与GenBank中同类酶序列相似性在44%-65%之间,97%活性泥来源序列与GenBank中同类酶的相似性在23%-77%之间,且序列多样性极为丰富,显示在有机磷污染土壤和活性泥中含有丰富和新颖的有机磷降解酶基因资源。同时采用PCR-DGGE的方法对有机磷污染土壤和活性泥中微生物多样性进行了初步研究。

来源于假单胞菌4-硝基酚降解基因簇中的偏苯三酚1,2-双加氧酶基因克隆和功能鉴定

通过富集培养的方法从农药厂废水曝气池的活性污泥中筛选到了一株既具有甲基对硫磷降解活性又可以有效降解4-硝基酚的高效菌株1-7,经16S rDNA鉴定为假单胞菌(Pseudom onassp.)。根据4-硝基酚降解相关基因保守区设计简并引物扩增小片段,再应用TAIL-PCR克隆得到偏苯三酚1,2-双加氧酶基因dio1,基因全长873 bp,编码290个氨基酸,酶蛋白理论分子量为32.8 kDa。doi1基因在E.coliBL21中过量表达,并通过N i-NTA亲和层析纯化,结果表明该酶具有正常的生物学活性,证明了假单胞菌1-7可以通过偏苯三酚途径降解4-硝基酚。初步探讨了假单胞菌1-7的4-硝基酚降解机制。

细菌Ⅰ型普鲁兰酶的研究进展

Ⅰ型普鲁兰酶以内切的方式专一性作用于普鲁兰糖或者支链多糖的α-1,6糖苷键,生成产物麦芽三糖或线性多糖。在工业应用中,Ⅰ型普鲁兰酶与其他糖苷水解酶协同作用于不同糖类底物,可得到类型多样的终产物,因此在食品、化工、制药等行业中有很重要的作用。目前对Ⅰ型普鲁兰酶的研究不仅包括筛选高产酶的菌株,还需得到酶学性质优良的酶蛋白,以适合工业生产工艺。综述了细菌来源的Ⅰ型普鲁兰酶的研究概况,包括酶学性质、基因的分离与克隆、微生物生产,并讨论了该酶在工业生产中的应用及其研究前景。

基于细菌同源蛋白预测细菌最适生长温度的研究

不同细菌有不同的最适生长温度,而基因序列与其最适生长温度密切相关。为探究其相关性,选取92个具有不同最适生长温度的细菌的全基因组序列为研究材料,通过寻找92个细菌共有的同源蛋白,并计算共有同源蛋白中氨基酸的频率,发现共有同源蛋白的氨基酸频率特征与其最适生长温度存在着显著的相关关系,其中蛋白质序列中的螺旋结构与其最适生长温度关系最大。该研究为揭示细菌对温度的适应机制,以及对蛋白质稳定性相关的分子设计具有重要的意义。

一株普鲁兰酶产生菌的筛选及其基因克隆和酶学特性研究

普鲁兰酶作为一种解支酶,能够特异地作用于多糖中的α-1,6糖苷键,将淀粉中高度分支的支链淀粉转变成直链淀粉。本文通过以普鲁兰糖为唯一碳源的功能平板筛选方法,从云南腾冲温泉淤泥中分离到1株产普鲁兰酶的菌株73号,经16S rDNA序列分析,该菌属于厌氧芽胞杆菌属(Anoxybacillus sp.)。通过普鲁兰酶的保守区片段扩增及序列比对,最终从该菌中克隆得到普鲁兰酶编码基因pul73,全长2121bp,编码706个氨基酸。将该基因在大肠杆菌BL21(DE3)中进行异源表达和纯化,获得酶蛋白Pul73最适温度50℃,最适pH6.0,在65℃有较好的热稳定性,保温30min后仍有72%的剩余酶活。50℃时Pul73对普鲁兰糖的Km为1.643mg/mL,其最大反应速度Vmax为1.34U/mg,kcat为535.8/s。

来源于Pseudomonas sp.1-7对硝基酚降解基因簇中的对苯二醌还原酶基因的克隆和功能鉴定

Pseudomonas sp.1-7可以利用对硝基酚(PNP)作为唯一的碳源,氮源和能源生长。为了鉴定菌株1-7代谢PNP的相关基因,本研究构建了菌株1-7基因组的Fosmid文库,并通过文库的筛选克隆得到一段长为12.3 kb的基因簇序列。序列分析显示,该基因簇中共有7个基因(pdcEDGFCBA)与PNP的代谢相关。其中PdcB与来源于Pseudomonas sp.WBC-3中的对苯二醌还原酶(PnpB)有98%的相似性。将pdcB基因在E.coliBL21中过量表达,并通过Ni-NTA亲和层析纯化重组蛋白PdcB。体外的酶活测定表明,PdcB为一个FAD和NADH依赖型的对苯二醌还原酶,能够催化对苯二醌降解并生成对苯二酚。

通过正交实验设计突变体组合提高甲基对硫磷水解酶OPHC2对乙基对硫磷的降解能力

分别自假产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenesC2-1)和假单胞菌(Pseudomonassp.1-7)中克隆得到甲基对硫磷水解酶基因ophc2和ophc3,其编码甲基对硫磷水解酶OPHC2和OPHC3的氨基酸序列相似性达98.5%,仅5个氨基酸残基不同,但酶学性质差异很大,特别是对不同底物降解特性有很大差异。OPHC2对甲基对硫磷的催化效率是OPHC3的2.75倍,对乙基对硫磷的催化效率仅为OPHC3的12.9%。为了提高OPHC2对乙基对硫磷的降解活性,以OPHC3的序列为依据,针对5个不同的氨基酸设计正交实验,对OPHC2进行组合突变,最终获得了一个突变体P165S/A169V,对乙基对硫磷的催化效率是OPHC2的1.19倍,对甲基对硫磷的催化效率是OPHC2的1.36倍。

基于优先连接和用户属性的链路预测算法研究

随着互联网的快速发展和移动互联网时代的到来,社交网络已然成为人们生活中不可或缺的一部分。链路预测好友推荐算法在社交网络中的应用是根据用户属性及其关系数据来预测用户之间未来关系的发展状况。目前的社交网络好友推荐算法所需的数据量级较大,占用资源较多,基于网络拓扑结构的链路预测相似性算法可以很好地解决这个问题,基于传统的相似性算法没有考虑到在线社交网络中的用户属性问题。文中将对链路预测相似性算法进行筛选优化,并考虑在线社交网络的无标度特性,提出一种结合PA算法与用户属性的混合相似性算法——PAA算法,同时将PAA算法应用于微博数据集中。结果表明,PAA算法的效果评价明显高于传统的基于网络拓扑结构的链路预测相似性算法。

Angular JS和Qt在室内定位系统中的混合开发应用

互联网的迅猛发展给我们生活带来进步的同时,也为混合开发提供了选择。将Qt结合前端框架Angular JS进行室内定位软件的开发。Qt进行嵌入式开发并利用Qt Webkit实现与Web页面的通信,Angular JS依靠其双向数据流实现逻辑处理与页面交互。这种方式提高了软件交互效率,是传统软件工程在互联网浪潮下的一次创新。

油田注水注采比计算方法研究

在油田开发中,仅使用油输差计算油田产水量会产生误差并导致油田注采失衡,本研究试图通过引入水输差来解决此类问题。分析油田实际数据发现,目前采用的核实产水量不能真实地反映油田的实际产水量,而水输差的引入解决了这一问题。为获得更真实的输差,将井口计量与流量计计量的产液量误差范围严格控制在3%以内,减小了因产液量不准造成的输差;同时,控制水输差可提高油输差反映含水准确度的真实性,实现了油输差和水输差的相互制约。建议将水输差与油输差一并使用,以更合理地认识油田的开发现状和开发趋势。

新三板挂牌上市的利与弊

正如任何事务都有两面性，物业服务企业在新三板市场挂牌，可以享受到众多的好处之外，其背后隐合的弊端与风险同样值得我们关注。

观点交锋 共话企业使命联盟未来——“互联网+时代的房地产”研讨会暨2015城市开发企业家联盟年会互动论坛

在"互联网+时代的房地产"研讨会暨2015城市开发企业家联盟年会上,部分开发和联盟企业参与了互动论坛,就互联网+、轻资产、现金流、上市等方面进行了面对面的交流,将会议推向了又一个高潮。本刊编辑部特对相关精彩内容整理报道,以飨读者。

一种新的有机磷降解酶基因ophc2的克隆与表达

将来源于假产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)的有机磷降解酶OPHC2进行了N端及内肽的氨基酸序列测定, 根据得到的氨基酸序列设计合成了简并引物, 通过PCR和反向PCR从Pseudomonas pseudoalcaligenes中克隆出有机磷降解酶基因ophc2. 编码基因全长975 bp, (G+C)含量为63%, 有一个可读框, 编码324个氨基酸, 酶蛋白理论分子量为36 kD. 编码基因的核苷酸序列分析表 明,与目前发表的有机磷降解酶基因相比同源性很低, 最高的只有46.4%, 说明这是一个新的有机磷降解酶基因. 将克隆得到的带有信号肽编码序列的和不带信号肽编码序列的有机磷降解酶基因, 分别与载体pET-30a构建重组表达质粒, 得到的表达产物具有正常的生物学活性.

启动子及信号肽筛选提高普鲁兰酶在地衣芽孢杆菌中的表达

普鲁兰酶(pullulanase)是一种淀粉脱支酶,在淀粉糖化加工等工业生产中具有重要的应用价值。选用地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) BL10作为表达宿主,为了提高其中的普鲁兰酶产量,对来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 168和地衣芽孢杆菌BL10中的15种不同信号肽以及4种不同启动子进行筛选,构建了不同的重组工程菌株,最终发现在以P43为启动子、apr为信号肽的条件下,上清液中普鲁兰酶的表达量最高,酶活可达12 U/m L,且测得其最适反应温度为60℃,最适p H为4.5。结果表明通过对启动子及信号肽进行筛选是提高重组工程菌株中目的蛋白表达量的一种有效手段。

普鲁兰酶基因工程研究进展

普鲁兰酶是一类淀粉脱支酶,能够专一性地切开支链淀粉分支中的α-1,6-糖苷键,形成直链淀粉。普鲁兰酶能够与其他淀粉酶协同作用,主要应用在以淀粉为原料的食品加工中,大规模地提高了淀粉的利用率和生产效率。目前已获得的普鲁兰酶在大肠杆菌、芽胞杆菌以及毕赤酵母表达系统中均实现了表达,然而其表达水平难以满足工业生产的需要。着重从普鲁兰酶的异源表达及优化、酶蛋白分子改良方面对近几年普鲁兰酶最新的研究进展进行了综述,为寻找更有效提高表达量的途径提供理论基础。