转胶蛋白沉默影响三阴性乳腺癌细胞凋亡和自噬的作用机制

目的 三阴性乳腺癌的发生发展机制尚未完全阐明,转胶蛋白(TAGLN)在三阴性乳腺癌中的作用机制也尚不明确。文中旨在探讨TAGLN基因沉默对三阴性乳腺癌Hs578T稳定细胞凋亡和自噬的影响及其机制。方法 确定Hs578T细胞的puromycin最佳筛选浓度;设计、合成TAGLN shRNA,构建TAGLN慢病毒干扰质粒sh1和sh2,分别包装含TAGLN shRNA(shRNA1和shRNA2)及对照shRNA(ctrl)的慢病毒并感染Hs578T细胞;puromycin筛选建立TAGLN沉默的Hs578T稳定细胞系(Hs578Tsh1和Hs578Tsh2)和对照稳定细胞系(Hs578TCtrl),qPCR和Western blot鉴定稳定细胞中TAGLN mRNA和蛋白的表达水平;在各组Hs578T稳定细胞中,用流式细胞术检测细胞凋亡率;Western blot检测检测Bax、Bcl-2、Caspase3、Cleaved-Caspase3、PARP、Cleaved-PARP等蛋白的表达情况。结果 Western blot和qPCR结果显示,与对照稳定细胞Hs578T Ctrl相比,TAGLN敲低细胞Hs578T sh1、Hs578T sh2的TAGLN蛋白表达(P<0.01),mRNA表达亦降低(P<0.01)。流式细胞术结果显示,敲低TAGLN的Hs578T sh1、Hs578T sh2稳定细胞较Hs578TCtrl细胞的总凋亡率分别增加100.7%、74.4%(P<0.01),早期凋亡率分别增加126.4%、85.7%(P<0.01),晚期凋亡率分别增加49.2%、51.9%(P<0.01)。Western blot结果显示,敲低TAGLN的Hs578T sh1、Hs578T sh2稳定细胞较Hs578TCtrl细胞的Bcl-2表达减少,Bax表达增多,Bax/Bcl-2比值分别增加148%、115%,Cleaved-PARP蛋白分别增加41%、34%,Capase3蛋白分别增加26%、11%,Cleaved-Caspase3蛋白增加27%、21%(P<0.01);敲低TAGLN的Hs578T sh1、Hs578T sh2稳定细胞较对照Hs578T Ctrl细胞的LC3-Ⅱ、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达减少,而P62蛋白表达均升高(P<0.01)。结论 成功构建了TAGLN沉默的Hs578T稳定细胞系及对照细胞系;TAGLN可能通过ERK1/2信号通路促进三阴性乳腺癌Hs578T稳定细胞的凋亡及抑制自噬通量。