miR-216b对顺铂耐药胃癌细胞生物学行为的影响

目的探讨miR-216b对顺铂耐药的胃癌细胞增殖和凋亡的作用及可能机制。方法采用实时荧光定量PCR法检测人胃黏膜细胞系GES-1、人胃癌细胞系SGC7901和胃癌顺铂耐药细胞系SGC7901/DDP的miR-216b相对表达量,采用Western blot法检测3种细胞ATG5蛋白相对表达量。SGC7901/DDP细胞加入不同浓度顺铂,采用CCK-8实验检测顺铂对细胞的半数抑制浓度,确定顺铂在后续实验中浓度。对数生长期SGC7901/DDP细胞随机分为空白对照组(正常培养)、agomir-NC组(转染agomir-NC)、agomir-miR-216b组(转染agomic-miR-216b)、antagomir-NC组(转染antagomir-NC)和antagomir-miR-216b组(转染antagomir-miR-216b),采用实时荧光定量PCR法检测5组细胞miR-216b相对表达量,采用Western blot法检测5组细胞LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、ATG5、P62蛋白相对表达量,采用CCK-8实验检测5组细胞活力,采用克隆形成实验检测5组细胞克隆细胞数,采用流式细胞术检测5组细胞凋亡率。采用荧光素酶报告实验检测miR-216b与ATG5的靶向结合。对数生长期SGC7901/DDP细胞随机分为agomir-NC+oe-NC组(转染agomir-NC和oe-NC)、agomir-MiR-216b+oe-NC组(转染agomir-miR-216b和oe-NC)和agomir-miR-216b+oe-ATG5组(转染agomir-miR-216b和oe-ATG5),采用实时荧光定量PCR法检测miR-216b相对表达量,采用Western blot法检测细胞ATG5蛋白相对表达量。结果SGC7901/DDP细胞miR-216b相对表达量(0.26±0.04)低于SGC7901细胞(0.49±0.06)和GES-1细胞(1.00±0.05)(P<0.05),SGC7901细胞低于GES-1细胞(P<0.05);SGC7901/DDP细胞ATG5相对表达量(0.76±0.03)高于SGC7901细胞(0.47±0.03)和GES-1细胞(0.18±0.02)(P<0.05),SGC7901细胞高于GES-1细胞(P<0.05);顺铂对SGC7901/DDP细胞的半数抑制浓度为7.998μmol/L,顺铂在后续实验中使用浓度为8μmol/L;agomir-miR-216b组细胞miR-216b相对表达量(2.43±0.14)、细胞凋亡率[(28.37±1.61)%]和P62蛋白相对表达量(0.43±0.02)高于agomir-NC组[1.02±0.05、(14.34±0.97)%、0.23±0.03](P<0.05),细胞活力[(25.20±2.75)%]、克隆细胞数[(49.33±5.51)个]、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ(0.22±0.02)和ATG5蛋白相对表达量(0.17±0.01)低于agomir-NC组[(51.39±3.05)%、(119.33±4.51)个、0.38±0.02、0.33±0.02](P<0.05);antagomir-miR-216b组细胞miR-216b相对表达量(0.33±0.02)、细胞凋亡率[(8.77±1.12)%]和P62蛋白相对表达量(0.12±0.02)低于antagomir-NC组[0.99±0.05、(14.40±1.06)%、0.22±0.01](P<0.05),细胞活力[(77.34±3.97)%]、克隆细胞数[(166.67±6.51)个]、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ(1.84±0.07)和ATG5蛋白相对表达量(0.83±0.04)高于antagomir-NC组[(49.25±4.00)%、(116.00±4.58)个、0.36±0.02、0.34±0.02](P<0.05);空白对照组、agomir-NC组、antagomir-NC组组间两两比较差异均无统计学意义(P>0.05)。miR-216b靶向调控ATG5。agomir-miR-216b+oe-NC组和agomir-miR-216b+oe-ATG5组细胞miR-216b相对表达量高于agomir-NC+oe-NC组(P<0.05),agomir-miR-216b+oe-NC组与agomir-miR-216b+oe-ATG5组比较差异无统计学意义(P>0.05);agomir-miR-216b+oe-NC组细胞ATG5蛋白相对表达量低于agomir-NC+oe-NC组和agomir-miR-216b+oe-ATG5组(P<0.05),agomir-miR-216b+oe-ATG5组低于agomir-NC+oe-NC组(P<0.05)。结论miR-216b可能通过靶向ATG5抑制自噬,促进细胞凋亡并抑制增殖,增加胃癌细胞对顺铂的敏感性。

miRNA-216b通过靶向调控Beclin1对顺铂诱导的胃癌细胞自噬及凋亡的影响

目的:探究miRNA-216b(miR-216b)对顺铂处理的胃癌细胞的影响及其可能的作用机制。方法:体外培养人胃黏膜细胞系GES-1、人胃癌细胞系SGC7901和胃癌顺铂耐药细胞系SGC7901/DDP,将SGC7901/DDP细胞随机分为空白对照组、agomir-NC+oe-NC组、agomir-miR-216b+oe-NC组、agomir-miR-216b+oe-Beclin1组,按照分组进行细胞转染,荧光素酶报告实验检测miR-216b与Beclin1的靶向结合;qPCR检测细胞miR-216b的表达;Western blot检测细胞Beclin1、LC3、p62、Bax和Bcl-2蛋白表达;CCK-8检测细胞活力;克隆形成实验检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡。结果:与GES-1组比较,SGC7901组细胞中miR-216b的表达显著降低(P<0.05),Beclin1蛋白表达显著升高(P<0.05);与SGC7901组比较,SGC7901/DDP组细胞中miR-216b的表达显著降低(P<0.05),Beclin1蛋白表达显著升高(P<0.05)。miR-216b靶向调控Beclin-1,与空白对照组比较,agomir-NC+oe-NC组SGC7901/DDP细胞中各指标差异无统计学意义;与agomir-NC+oe-NC组比较,agomir-miR-216b+oe-NC组SGC7901/DDP细胞中miR-216b的表达显著升高(P<0.05),Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.05),细胞活力和克隆数显著降低(P<0.05),细胞凋亡率、Bax和p62蛋白表达显著升高(P<0.05);与agomir-miR-216b+oe-NC组比较,agomir-miR-216b+oe-Beclin1组SGC7901/DDP细胞中Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Bcl-2蛋白表达显著升高(P<0.05),细胞活力和克隆数显著升高(P<0.05),细胞凋亡率、Bax和p62蛋白表达显著降低(P<0.05)。结论:miR-216b通过靶向调控Beclin1抑制自噬并促进凋亡,增加SGC7901/DDP细胞顺铂敏感性。

上调lncRNA SNHG12与miR-199a-5p/FZD6轴对肝细胞癌细胞增殖、侵袭和上皮-间质转化的影响

背景与目的:肝细胞癌(HCC)是临床上常见的恶性肿瘤之一,侵袭、转移和术后复发是导致HCC患者死亡的主要原因。目前认为长链非编码RNA(lncRNA)的失调可能与各类癌症的发生和转移有关。有研究显示lncRNA SNHG12在HCC组织表达明显上调,但其具体功能尚不清楚。故本研究探讨lncRNA SNHG12在HCC细胞中的作用及机制。方法:用qRT-PCR检测SNHG12以及预测到的靶miRNA及靶基因(miR-199a-5p与FZD6)在HCC细胞HepG2细胞与人肝内胆管上皮细胞HIBEC中的基因表达量,观察下调SNHG12对HepG2细胞增殖、侵袭和上皮-间质转化(EMT)相关蛋白表达的影响;采用miRanda和双荧光素酶报告基因实验分析SNHG12和miR-199a-5p之间的关系,分析下调miR-199a-5p对HepG2细胞增殖、侵袭和EMT的影响,以及SNHG12对miR-199a-5p作用的影响;TargetScan和双荧光素酶报告基因实验分析miR-199a-5p和FZD6的关系;检测过表达及下调FZD6对HepG2细胞增殖、侵袭和EMT的影响,以及SNHG12和miR-199a-5p对FZD6表达的影响。结果:与HIBEC细胞比较,HepG2细胞中SNHG12表达量明显升高、miR-199a-5p表达量明显降低、FZD6表达量明显升高(均P<0.01)。下调SNHG12表达,HepG2细胞增殖、侵袭和EMT被明显抑制,过表达SNHG12作用则相反(均P<0.05)。SNHG12与miR-199a-5p特异性结合,下调miR-199a-5p促进HepG2细胞增殖、侵袭与EMT,过表达miR-199a-5p则起到抑制作用(均P<0.05)。过表达miR-199a-5p对HepG2细胞的作用,能部分被同时过表达SNHG12所逆转(均P<0.05)。miR-199a-5p靶向FZD6,下调FZD6后HepG2细胞增殖、侵袭与EMT明显抑制,过表达FZD6则相反(均P<0.05)。下调SNHG12抑制FZD6的基因和蛋白表达,而下调miR-199a-5p则促进FZD6的表达(均P<0.01);与单独下调miR-199a-5p比较,同时下调SNHG12和miR-199a-5p,FZD6的表达被抑制(P<0.01)。结论:HCC细胞中lncRNA SNHG12的上调可能通过影响miR-199a-5p/FZD6轴促进HCC细胞的增殖、侵袭和EMT过程。