含hITF基因cDNA的腺病毒载体的构建及其感染肠上皮细胞的研究

目的构建含有人肠三叶因子基因cDNA的腺病毒载体,并观察其对肠上皮细胞的感染能力。方法利用PCR技术扩增hITF基因cDNA全长序列,测序后亚克隆至腺病毒穿梭质粒,转化至含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1大肠杆菌株BJ5183感受态细胞中进行同源重组,内切酶PmeⅠ线性化后转染HEK293细胞进行病毒包装及扩增,并进行滴度测定。将重组腺病毒感染肠上皮细胞(HT-29),荧光显微镜观察感染效果。结果成功构建出重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-hITF,PmeⅠ线性化后与骨架质粒pAdEasy-1同源重组,PacⅠ酶切鉴定后命名为Ad-hITF;重组腺病毒载体在HEK293细胞中包装,获得重组腺病毒颗粒;根据Karbers公式计算病毒颗粒滴度为2×109 pfu/mL;重组腺病毒可以感染肠上皮细胞(HT-29),感染效率较高。结论成功构建含hITF基因cDNA的重组腺病毒载体并获得大量子代重组腺病毒,为腺病毒介导hITF基因治疗的应用打下基础。

壳聚糖-肠三叶因子纳米粒制备与体外转染的实验研究

目的:构建hITF基因传递系统,检测其细胞转染效果。方法:首先构建肠三叶因子(intestinal trefoil factor,ITF)的真核表达载体,再利用复凝法制备壳聚糖纳米粒,用透射电镜观察纳米粒的形态及大小,并利用HEK293细胞检验纳米粒的转染能力,最后利用RT-PCR和Western blot检测目的基因的转录及表达情况。结果:成功构建出hITF真核表达载体,利用复凝法制备了不同N/P比的壳聚糖纳米粒,透射电镜观察到粒度<1 000 nm,粒径呈窄分布;荧光显微镜及流式细胞仪检测显示,壳聚糖纳米粒对HEK293细胞的转染率约为80%,和脂质体的转染率基本一致;RT-PCR和Western blot检测说明hITF被成功转录并分泌表达。结论:成功构建了hITF理想的基因传递系统,为壳聚糖介导hITF基因治疗的应用打下基础。

ITF通过JAK-STAT3途径上调自身启动子的活性

目的:研究肠三叶因子(intestinal trefoil factor,ITF)对自身启动子活性的影响及Janus激酶/信号转导和转录激活因子(Janus kinase/signal transducers and activators of transcription,JAK/STAT)信号通路对其的调控作用。方法:以人全血基因组DNA为模板,PCR获取ITF基因5'侧翼序列,插入p GL3-Basic载体,构建ITF启动子重组载体;以不同浓度的ITF刺激,检测双荧光素酶的活性;运用JAK-STAT3通路特异性抑制剂AG490阻断JAKSTAT3信号通路,观察AG490对ITF启动子活性的影响。结果:酶切和直接测序法证实包含ITF启动子的重组质粒构建成功;瞬时转染实验显示,ITF能显著提高ITF启动子的活性(P<0.05);加入AG490后ITF启动子活性显著下降(P<0.05)。结论:ITF通过JAK-STAT3途径上调自身启动子的活性。

腺病毒介导人肠三叶因子基因对肠上皮细胞的影响

目的 构建含有人肠三叶因子（hITF）基因的腺病毒载体,并观察其对肠上皮细胞的影响.方法 首先构建重组腺病毒载体,并感染人肠上皮细胞株Caco-2;然后行反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）及Western blot检测,从mNRA及蛋白水平检测hITF表达;感染病毒细胞做爬片后行细胞免疫荧光检查;最后通过划痕实验,检测重组腺病毒对肠上皮细胞迁移功能的影响.结果 成功构建出重组腺病毒,可以感染人肠上皮细胞株Caco-2,感染效率接近100％;RT-PCR和Western blot检测证实,hITF被成功转录并分泌表达;细胞免疫荧光显示,hITF可表达于细胞核和细胞质,但以细胞质为主;划痕实验证明感染重组腺病毒对肠上皮细胞具有很强的促迁移能力,重组腺病毒组迁移距离为（216.67±16.43） μm,显著高于空载病毒组的（68.00±8.37） μm和对照组的（68.00±8.37）μm.结论 成功构建了含hITF基因的腺病毒载体,该载体对肠上皮细胞具有促迁移作用,为hITF基因治疗的应用打下基础.

肠三叶因子启动子荧光素酶报告基因载体的构建及活性分析

目的:克隆肠三叶因子(ITF)启动子序列,构建ITF启动子荧光素酶报告基因载体,并检测启动子活性。方法:运用PCR方法从人全血基因组DNA中获得目的基因;双酶切后连接到荧光素酶报告基因载体上,构建不同长度的ITF启动子报告基因载体(-100--1 826bp);将重组质粒转染至HEK293细胞和LS174细胞48h后,采用双荧光素酶报告基因系统检测其启动子活性。结果:PCR扩增出不同长度的ITF启动子片段;双酶切及测序鉴定重组体构建正确;转染HEK293细胞和LS174细胞后检测启动子活性,100和200bp启动子活性较低,而300至1 826bp启动子活性较强。结论:成功构建了ITF启动子报告基因载体,具有活性的启动子最小长度为300bp。