基于RNA-seq的甲氨蝶呤处理sv129胚胎干细胞的转录组学分析

目的利用转录组测序(RNA sequencing,RNA-seq)技术探讨抗叶酸代谢药物甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)处理的小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells,mESC)基因转录表达的变化,并探讨其可能影响的生物学过程和关键信号通路。方法将mESC分为两组,其中对照组采用完全培养基培养,MTX组在此基础上加入0.12μmol/L MTX药物处理。MTX处理24 h分别收集细胞,提取总RNA进行RNA-seq,获得胚胎早期全基因转录组图谱并采用Deseq2软件筛选差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs),采用生物信息学R软件包对MTX组与对照组进行差异基因的功能及通路分析。结果MTX组与对照组的转录组相比,共有365个DEGs,其中144个显著上调表达,221个显著下调。GO(Gene Ontology)功能富集分析显示,生物学过程(biological process,BP)分类集中在肌肉系统发育、肌肉收缩、肌纤维发育等肌肉系统发育过程,细胞组分(cellular component,CC)分类集中在细胞膜组分、肌原纤维、收缩纤维、肌丝、肌节等肌肉组分,分子功能(molecular function,MF)分类集中在跨膜转运蛋白结合活性及膜通道活性。KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)生物功能分析显示DEGs显著性富集的通路在钙信号通路、紧密连接。结论抗叶酸代谢药物甲氨蝶呤能够引起mESC基因组的转录改变,DEGs功能主要与肌肉发育以及肌肉纤维发育相关,同时DEGs富集的关键信号通路主要有肌肉发育相关的膜通道的钙离子信号通路和紧密连接。

AXIN2罕见变异与人类神经管畸形的相关性研究

目的探索AXIN2基因变异与神经管畸形(neural tube defects,NTDs)发生的相关性。方法收集2004年6月-2013年12月山西省9家医院引产的100例NTDs胎儿肌肉组织样本,对其全基因组测序结果中的AXIN2基因的变异进行生物信息学分析,在相应的样本中利用Sanger测序证实变异结果。在NE-4C细胞系中转染AXIN2野生型及AXIN2变异型质粒,利用免疫荧光和蛋白免疫印迹实验进行基因功能验证,对携带AXIN2变异的人NTDs样本进行分析。结果在100例NTDs样本中发现AXIN2基因上有5种变异,对其中3种变异[c.959A>T(p.D320V)、c.1250C>T(p.A417V)和c.1634G>A(p.G545E)]进行功能验证。细胞蛋白免疫印迹实验表明,D320V(P<0.05)和G545E(P<0.001)变异下调AXIN2蛋白表达,但3种变异均不影响β-catenin蛋白表达水平;免疫荧光实验表明,3种变异不影响AXIN2蛋白的亚细胞定位。在携带D320V及G545E变异的NTDs胚胎肌肉组织中,AXIN2的蛋白表达水平显著低于对照[D320V(P<0.05),G545E(P<0.01)]。结论NTDs样本中鉴定到的AXIN2变异D320V及G545E下调AXIN2蛋白表达量,可能通过引起Wnt信号通路异常激活而导致神经管畸形的发生。

久坐行为对学龄前儿童肌肉力量的影响

目前的研究尚未明确久坐行为(sedentary behavior,SB)与肌肉力量(muscle strength,MS)之间的关系,尤其缺乏国内学龄前儿童的相关证据。为探讨SB对3~6岁学龄前期儿童MS的作用,采用横断面研究设计,以北京市3~6岁学龄前儿童为研究对象(n=275),利用握力测试和立定跳远测试分别对上、下肢肌肉力量进行评测,根据肌肉力量标准分公式,结合测评结果计算得出MS的T分;连续佩戴7 d ActiGraph GT9X Link加速度计以评估学龄前儿童的SB的总时间、持续SB时间。结果显示,在控制性别、年龄、家庭年收入,父、母亲学历因素之后,SB的总时间和持续SB时间与肌肉力量均呈显著负相关,SB的总时间每增加10 min/d,MS的T总分下降0.739(95%CI:-1.122,-0.355),持续SB时间每增加10 min/d,MS的T总分下降0.825(95%CI:-1.644,-0.007)。此外,上肢MS和下肢MS与SB的总时间均呈显著负相关,SB的总时间增加10 min/d,上肢MS的T分降低0.427(95%CI:-0.664,-0.189),下肢MS的T分下降0.312(95%CI:-0.533,-0.091)。结果表明SB的总时间和持续SB时间与MS总T分值均呈显著负相关,对于MS而言,SB可能是一个风险因素。为促进学龄前儿童的肌肉力量的发育,应该控制学龄前期儿童的SB的总时间和持续SB时间。

人甲3型流感病毒基质蛋白及其诱导抗体在临床检测中的应用

目的探讨抗重组人甲3型流感病毒基质蛋白(M1)抗体在临床检测中应用的可行性。方法在生物信息学分析的基础上,经逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从人甲3型流感病毒感染细胞中获得目的基因,构建pET-28c(+)/IFV.M1P2重组质粒并在BL21DE3中诱导表达;重组蛋白经亲和层析纯化后免疫家兔制备多克隆抗体。采用间接免疫荧光法检测重组蛋白抗体与病毒感染细胞和临床标本的反应性,并与流感病毒凝血抑制试验结果比较分析,确定重组蛋白抗体的灵敏度和特异性。结果间接免疫荧光法检测抗M1P2重组蛋白抗体与人甲3型﹑甲1型流感病毒反应的抗体滴度可达1∶1200和1∶1000,与乙型流感病毒及其他呼吸道常见病毒无特异性反应。同样方法检测262例上呼吸道感染患儿鼻咽分泌物标本,阳性18例(6.87%),凝血抑制试验阳性24例(9.16%)。与凝血抑制试验相比,间接免疫荧光法检测敏感性为62.5%,特异性为98.7%。结论重组M1P2蛋白具有较强的免疫原性,可模拟天然病毒蛋白诱导产生较强的抗人甲3型流感病毒抗体,该抗体具有较高的反应特异性和一定的灵敏度。

肺炎支原体P1蛋白抗原决定簇在大肠杆菌中的表达与纯化

目的 得到肺炎支原体主要粘附蛋白 (P1蛋白 )的表达蛋白。材料与方法 用PCR产物限制性片段长度多肽性(RFLP)分析等方法鉴定实验用肺炎支原体菌株。针对P1蛋白基因设计上、下游引物 ,进行PCR扩增。对PCR产物进行回收、纯化 ,克隆入PET - 2 8C(+)表达载体 ,并转化入宿主菌BL2 1。对重组质粒进行酶切及PCR鉴定后 ,IPTG诱导目的蛋白在大肠杆菌BL2 1(DE3)中表达 ,并以Ni-Agarose亲和层析柱纯化。结果 1)本实验所用菌株为肺炎支原体 2型。 2 )经PCR扩增得到预期含有BamHI和XhoI的 5 33bp的目的片段。 3)完成目的基因片段的克隆与表达 ,得到 2 0kDa左右表达蛋白。经诱导阳性质粒的蛋白表达 ,得到较大量纯化的目的蛋白。结论 本研究以国际标准株FH为模板 ,成功获得纯化的近 2 0kDa的P1蛋白片段 ,其大小与目的片段理论值相符 ,且此片段在肺炎支原体 1型与 2型中的基因同源性为 98%。为在基因和蛋白水平进一步研究肺炎支原体P1蛋白成分在肺炎支原体粘附和引起机体免疫反应中的作用机制 ,打下了良好的基础。

用抗合成多肽抗体分析呼吸道HAdV六邻体保守区抗原表位

目的 分析人类腺病毒 (HAdV)六邻体保守区氨基酸序列 ,合成保守区多肽并制备抗多肽抗体 ,以确定型间共同的特异性表位。方法 用ClustalX、Antheprot等软件 ,对HAdV六邻体进行分析 ,确定保守区并分析其抗原性。合成抗原性多肽 ,免疫家兔制备抗肽多克隆抗体。用间接免疫荧光法和Westernblot法 ,检测所制备的抗肽抗体与病毒抗原的反应性。结果 根据HAdV 2六邻体的保守区合成 9种肽段 ,分成 3组免疫家兔 ,共获得 3组抗肽抗体。所有的抗肽抗体在 1∶10 0 0稀释度时 ,与 3个型别的HAdV感染细胞裂解物中相对分子质量 (Mr)约为 116 0 0 0的六邻体亚单位具有特异性反应。抗肽抗体对HAdV感染细胞有特征性荧光染色。 3组抗肽抗体中 ,有 7个抗体与 3个型别的HAdV感染细胞均具有阳性染色反应。结论 合成的保守区多肽能够诱导抗肽抗体产生 ,诱导产生的抗体与HAdV 3、 4、 7具有免疫反应性。

DNA总体低甲基化、错配修复基因启动子甲基化异常与神经管畸形的相关性

目的研究神经管畸形(NTDs)胚胎脑组织和皮肤组织DNA总体甲基化以及错配修复基因启动子区甲基化水平。方法在山西省吕梁地区以医院为基础进行病例-对照研究。从县级医院及妇幼保健院收集经B超诊断为NTDs的胎儿标本,同时收集非病理性引产、无畸形和发育迟缓的胎儿作为正常对照组。运用甲基化定量试剂盒测定脑组织和皮肤组织的DNA总体甲基化水平,甲基化特异性多连接依赖性探针扩增试剂盒检测7个错配修复基因(MLH1,MSH2,MSH6,MSH3,MLH3,PMS2和MGMT)启动子区甲基化水平。结果共有65例NTDs胚胎,48例对照胚胎进入研究。①NTDs组的脑组织DNA总体甲基化水平显著低于对照组(5.3%vs6.5%,P<0.001),DNA总体低甲基化显著增加了NTDs发生风险(OR=4.98,95%CI:1.42～17.53)。皮肤组织DNA总体甲基化水平在两组间差异无统计学意义(13.3%vs13.1%,P>0.05);②NTDs和对照组的MSH6启动子(MSH6-301:2.5%vs3.7%,P<0.05)和PMS2启动子(PMS2-328:5.7%vs6.7%;PMS2-142:2.0%vs2.7%,P<0.05)的甲基化水平存在显著差异。结论 DNA总体低甲基化、错配修复基因启动子区的异常甲基化修饰与NTDs发生有关。

肺炎支原体重组P1蛋白抗体研究

目的研制针对肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,Mp)主要粘附蛋白-P1蛋白的特异性抗体。方法用纯化后重组P1蛋白免疫BALB/c小鼠,获得多克隆抗体(Polyclonal Antibody,PcAb),通过传统的杂交瘤技术制备抗P1重组蛋白单克隆抗体(Monoclonal Antibody,McAb),采用ELISA和IFA法对单抗和多抗进行反应性和特异性检测。结果ELISA法检测P1重组蛋白抗原性显示,P1蛋白与Mp抗血清有较好的反应性,蛋白敏感性大于1ng/ml;在重组P1蛋白免疫小鼠获得的PcAb与Mp的反应中,检测到的抗体滴度可达到1∶1600;获得针对Mp重组P1蛋白的特异性McAbs2株,在ELISA检测中均与P1抗原有较好的反应特异性,抗体滴度可达到1∶800～1600;IFA结果显示,上述PcAb和McAbs均与Mp有较好反应性,与生殖支原体等无交叉反应。结论本研究选取的重组P1蛋白具有较好的免疫原性;其特异性PcAb和McAbs与Mp有较好的特异性,为临床Mp感染的抗原快速、早期诊断方法的建立打下了基础。

抗人3型副流感病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备及其活性鉴定

目的制备抗人3型副流感病毒核衣壳蛋白特异性单克隆抗体,为研发3型副流感病毒新型诊断试剂提供基础。方法利用重组克隆表达技术,获得可溶性的重组核衣壳蛋白;采用纯化的重组核衣壳蛋白免疫小鼠,采用杂交瘤技术制备抗人3型副流感病毒核衣壳单克隆抗体;采用ELISA及间接免疫荧光法筛选并鉴定可识别天然3型副流感病毒核衣壳蛋白单克隆抗体。结果获得9株分泌抗重组核衣壳蛋白的特异性单克隆抗体的细胞株,其中2株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体能识别天然的3型副流感病毒核衣壳蛋白。结论利用重组核衣壳蛋白作为免疫原制备出了识别天然核衣壳蛋白的单克隆抗体,并且具有较高的反应性。

血清叶酸相关代谢与出生缺陷发生的关系研究

目的比较出生缺陷高发和低发地区——山西吕梁和北京怀柔地区孕妇血清叶酸、维生素B_12及其代谢产物同型半胱氨酸水平，探讨造成两地出生缺陷发生率差异的营养学因素。方法选择吕梁地区的140名孕妇和怀柔地区的133名孕妇作为研究对象，采集研究对象的静脉血，比较两地区孕妇血清叶酸、维生素B_12和同型半胱氨酸水平差异。结果吕梁地区孕妇血清平均叶酸、维生素B_12水平显著低于怀柔地区（t值分别为6．10、13．77，均P〈0．05）。同时吕梁地区孕妇血清同型半胱氨酸水平显著高于怀柔地区（t=15．32，P〈o．05），吕梁地区叶酸、维生素B_12缺乏率显著高于怀柔地区（X^2值分别为7．84、61．02，均P〈0．05）。结论出生缺陷高发地区孕妇血清叶酸、维生素B12水平显著偏低，叶酸相关一碳单位代谢水平异常在一定程度上解释了高出生缺陷发生率的原因。

人神经营养因子4基因的分子克隆及序列分析

以正常人血淋巴细胞染色体ＤＮＡ为模板，ＰＣＲ扩增出神经营养因子４（ＮＴ４）编码基因．将所得基因片段重组于噬菌体载体Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦ，筛选得到含人ＮＴ４基因的克隆．采用Ｓａｎｇｅｒ单链末端终止法测出其全部的核苷酸序列，该序列与国外文献所报道的完全一致．

中国人β神经生长因子基因的分子克隆、序列分析及其在哺乳动物细胞中的分泌表达

以正常人血淋巴细胞染色体ＤＮＡ为模板，ＰＣＲ扩增出短体前β神经生长因子（ｐｒｅ－ｐｒｏ－β－ＮＧＦ）编码基因。将所得基因片段重组于Ｍ１３噬菌体载体，筛选得到含中国人ｐｒｅｐｒｏ－β－ＮＧＦ基因的克隆。采用Ｓａｎｇｅｒ单链末端终止法测出其全部的核苷酸序列，该序列与国外文献所报道的仅有一个碱基不同。将该基因亚克隆于真核表达载体ｐＥＶ１，经转染哺乳动物细胞ＢＨＫ后，在培养上清中检测到了成熟型β－ＮＧＦ。

人流感病毒核蛋白的重组表达及其抗原性分析

目的 探索用原核表达的人甲3型流感病毒核蛋白（NP）免疫小鼠所获得的抗重组蛋白抗体检测甲型流感病毒的可行性。方法 用Clustal X，Antheprot等软件，对IFV-A3 NP进行分析，确定保守区并分析其抗原性。RT-PCR获得NP基因，分3段克隆NP基因到PET-28（C），并在BL21中诱导表达。经Ni-Agarose亲和层析柱纯化后，免疫BALB／c鼠制备抗重组蛋白抗体。用Western Blot和免疫组化法检测抗重组蛋白抗体与病毒抗原的反应性。结果 重组质粒在BL21中高效表达，表达量为15～20mg／L菌液。Western Blot检测显示，抗NP1、NP2、NP3多克隆抗体（1：2000）均对流感病毒NP具有反应性。免疫组化检测也显示，抗NPI、NP2、NP3多克隆抗体对IFV-A3、-Al感染的MDCK细胞有特异性染色，抗体滴度从1：640到1：1280。结论 重组表达的NP能够诱导产生高效价多克隆抗体，所产生的抗体与IFV-A3、Al具有交叉免疫反应性。通过生物信息学分析预测抗原性并制备多克隆抗体是可行的，并可望用于流感病毒感染的早期快速诊断的研究中。

腺病毒六邻体蛋白型间线性化抗原位点的研究

目的 对人类腺病毒 (adenovirus,AdV)六邻体型间抗原位点的特性进行研究。方法 通过计算机对腺病毒六邻体氨基酸序列进行比较分析 ,结合抗原性的预测结果和六邻体蛋白三维空间结构的肽段暴露状态 ,选定了保守性抗原位点进行多肽合成或通过构建重组质粒表达蛋白 ,将合成的六邻体肽段和表达纯化的蛋白抗原免疫动物后 ,用免疫印迹和间接免疫荧光方法检测抗血清的免疫特异性。结果 免疫印迹分析显示 ,抗多肽抗体和抗重组蛋白抗体均与腺病毒的六邻体蛋白特异性识别。间接免疫荧光显示 ,腺病毒感染HeLa细胞核内荧光着色 ,并且抗血清有较好的腺病毒型间反应性。合成多肽抗体与含有相同肽段的重组蛋白抗原产生特异性结合。结论 在腺病毒六邻体蛋白中存在有线性化的型间抗原位点 。

肺炎支原体P1重组蛋白多克隆抗体与单克隆抗体的制备与比较

肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae，Mp）是引起人类原发性非典型肺炎及其他呼吸道感染性疾病的常见病原微生物，不做病原学检查，很难将Mp与其他病原体引起的呼吸道感染相区别。本研究利用具有抗原特异性的重组P1抗原，研制特异、敏感的抗体，为建立临床标本的怖抗原诊断方法奠定了基础。

应用CRISPR/Cas9系统构建MTHFD1基因敲除的HEK-293细胞系

目的:利用成簇的、规律间隔的短回文重复序列/Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9)基因编辑技术构建亚甲基四氢叶酸脱氢酶1(methylenetetrahydrofolate dehydrogenase 1, MTHFD1))基因敲除人胚肾(HEK-293)稳定细胞系。方法:利用在线软件筛选出评分最高的3条针对MTHFD1基因的单向导RNA (sg RNA),然后合成sg RNA序列并将其插入到含有GFP标签的质粒中;重组质粒转染HEK-293细胞后通过流式细胞仪分选出已被转入sg RNA的单细胞,通过测序确认单克隆细胞系中MTHFD1的DNA序列突变状态;最后应用实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(real-time quantitative Polymerase Chain Reaction, RT-q PCR)和蛋白质印迹(Western blot)方法检测单克隆细胞中MTHFD1的m RNA和蛋白表达水平。结果:重组载体中含有正确的sg RNA序列;测序结果显示该细胞系中MTHFD1基因发生了单个碱基插入突变和6个碱基的缺失突变;RT-qPCR结果显示单克隆细胞系中MTHFD1在m RNA水平显著降低;Western blot检测成功构建MTHFD1蛋白缺失的HEK-293细胞。结论:本研究利用CRISPR/Cas9技术成功构建的MTHFD1敲除HEK-293细胞系。

PRKCI基因单核苷酸多态性与神经管畸形的相关性研究

目的探讨PRKCI基因单核苷酸多态性(SNP)与中国山西省神经管畸形(NTDs)发生的相关性。方法采用病例对照研究,利用MassARRAY分子量阵列分析平台,检测133例NTDs标本和135例非病理性胎儿标本PRKCI基因中17个标签SNPs的基因分型,分析其与NTDs发生的相关性。结果 17个SNPs位点中,16个的微效等位基因频率(MAF)与HapMap或dbSNP数据库的结果基本一致。除rs9876082外,其余SNPs位点的基因型分布和等位基因频率在病例组和对照组均无明显差异。rs9876082位点为纯合的微效等位基因A时,NTDs的发病率增加(P=0.035,比值比=2.135,95%可信区间=1.846-2.471),但是调整其它变量后进行logistic回归分析,这种相关性不再明显(P=0.057)。结论 PRKCI基因rs9876082位点与NTDs的发生有弱的相关性,这种相关性需进一步加大样本进行验证,PRKCI基因可能不是通过其SNPs影响NTDs的易感性。

山西省吕梁地区孕妇人群TMPRSS6基因多态性与血清铁蛋白和可溶性转铁蛋白受体水平的相关性

目的分析TMPRSS6基因多态性与孕妇人群血清铁蛋白(SF)和可溶性转铁蛋白受体(s TfR)之间的关系。方法采用整群随机抽样的方法,于2014年在山西吕梁地区选取孕期妇女807名。使用免疫比浊法检测研究对象的SF和s TfR的浓度,并分别按照SF <25 ng/m L和s TfR> 4. 4 mg/L的标准对研究对象进行铁缺乏(ID)的判定。使用Sequenom MassArray系统对样本的rs11704654、rs1421312、rs2111833、rs2235321、rs2543519、rs4820268和rs855791位点进行分型检测。结果rs2111833的各基因型之间Ln SF水平的差异有统计学意义(F=3. 57,P=0. 0287),其中T等位基因携带者人群的Ln SF水平低于CC纯合子携带者人群(t=2. 03,P=0. 0429); rs855791的A等位基因携带者Ln SF水平低于GG纯合子携带者人群(t=1. 97,P=0. 0490)。rs11704654中T等位基因携带者人群SF <25 ng/m L的率大于CC纯合子携带者人群(χ~2=4. 5456,P=0. 0330); rs2111833中T等位基因携带者人群SF <25 ng/m L的率大于CC纯合子携带者人群(χ~2=4. 6431,P=0. 0312);rs855791中GG纯合子携带者人群SF <25 ng/m L的率小于A等位基因携带者人群(χ~2=5. 0134,P=0. 0263)。三个位点经过Logistic分析,并用年龄和孕周进行调整后,rs11704654(T)和rs855791(A)与SF <25 ng/m L的关联性依然存在。在与s TfR水平的关联性分析中,rs11704654的T等位基因携带者人群Ln s TfR水平高于CC纯合子携带者人群(t=-2. 012,P=0. 024); rs2543519的G等位基因携带者人群Ln s TfR水平高于AA纯合子携带者人群(t=-1. 954,P=0. 011)。结论在孕妇人群中,TMPRSS6基因的多态性与SF和s TfR水平存在关联。