甘肃文县婴儿利什曼原虫无症状感染犬的检测

目的评价PCR法、ELISA法和试条法检测我国婴儿利什曼原虫无症状感染犬的潜能。方法用两组PCR引物RV1-RV2和K13A-K13B检测动物源型黑热病疫区健康犬静脉血和骨髓中利什曼原虫特异DNA,以利什曼原虫可溶性抗原为包被抗原的ELISA法和rk39-dipstick试条法分别检测利什曼原虫特异抗体,并比较各种检测方法的敏感性差异。结果PCR法检测抗凝静脉血和骨髓的阳性率分别为50.63%(40/79)和69.62%(55/79),两种样本总检出率为77.21%(61/79);ELISA法检测的阳性率为22.22%(16/72),而rk39-dipstick试条检测的阳性率为33.33%(19/57)。结论我国动物源性黑热病疫区利什曼原虫无症状感染犬的比例相当高,以骨髓为样本的PCR检测法为较精确的犬无症状感染检测方法。

甘肃省文县流行区人群婴儿利什曼原虫无症状感染现状

目的分析甘肃省文县内脏利什曼病流行区人群利什曼原虫无症状感染现状,评价PCR、ELISA和rK39免疫层析试条法检测利什曼原虫无症状感染的潜能。方法2004年10月在甘肃文县对269例无内脏利什曼病现症及病史的人群采取随机取样法采集静脉血,分别用RV1-RV2和K13A-K13B两组PCR引物检测血样中的利什曼原虫特异DNA,以利什曼原虫可溶性抗原为包被抗原的ELISA法和rK39免疫层析试条法分别检测利什曼原虫特异性抗体,并比较几种检测方法的敏感性。结果PCR、ELISA和rK39免疫层析试条法检测人群利什曼原虫无症状感染的阳性率分别为30.9%(83/269)、24.2%(65/269)和0(0/269)。结论甘肃省文县内脏利什曼病流行区人群存在大量利什曼原虫无症状感染者,PCR是检测无症状感染较敏感、特异的方法。

BALB／c小鼠感染都兰利什曼原虫后抗原／抗原抗体复合物的检测

采用能使动物及人致皮肤利什曼病的都兰利什曼原虫接种２２只ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，分别于５、１０、３０、６０和９０天剖检，结果仅在小鼠后足垫皮肤组织涂片中查见原虫，而肝脏，脾脏和骨髓组织涂片均未能查到利什曼原虫。同时以ＨＲＰ－Ｗ１Ｃ１０８．３进行ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ试验，检测感染小鼠足垫皮肤组织内抗原及血清内抗原抗体复合物的情况，结果显示，ＢＡＬＢ／ｃ小鼠在感染都兰利什曼原虫的第５天起，其皮肤组织与血清即呈阳性反应，且随感染时间延长和原虫负荷的加大，其阳性滴度也逐渐升高。

PCR检测婴儿利什曼原虫无症状感染的研究

目的建立适合检测我国婴儿利什曼原虫无症状感染的PCR方法。方法选择6种常用于诊断内脏利什曼病的PCR引物(RV1-RV2、K13A-K13B、MC1-MC2、174-798、Pia3-Pia4和DBY-Ajs31),以培养的甘肃人株利什曼原虫前鞭毛体种植人抗凝全血抽提的DNA为模板,确定了这6种PCR引物检测我国婴儿利什曼原虫的最适条件,并比较其检测的敏感性和特异性。选用两种敏感性和特异度均佳的引物对采自利什曼病疫区100份无利什曼病症状居民的静脉血进行检测。结果6种PCR引物检测的特异性均达到100%,而检测的敏感性各异,检测到的原虫数目从0.1～1000条原虫/ml,其中引物RV1-RV2(0.1个原虫/ml血)和K13A-K13B(1个原虫/ml血)敏感性较高。这两对引物对100份无症状居民血的阳性检出率分别为33%(33/100)和30%(30/100)。结论引物RV1-RV2和K13A-K13B适于检测我国婴儿利什曼原虫无症状感染。在我国甘肃动物源性利什曼病疫区,人群利什曼原虫无症状感染率颇高。

华支睾吸虫特异性富甘氨酸2a类抗原基因的克隆、表达和免疫学诊断价值评价

目的采取免疫学方法筛选华支睾吸虫成虫cDNA表达文库,寻找新的抗原基因。方法使用华支睾吸虫病人混合血清以及华支睾吸虫排泄分泌抗原的免疫小鼠血清,分别免疫学筛选华支睾吸虫成虫λZAP cDNA表达文库;将阳性噬菌体克隆、测序以及核苷酸序列比对分析;将目的基因的编码区克隆至原核表达质粒pET28a(+)中,采用制备不带N端融合标签的天然蛋白的策略表达融合蛋白,使用组氨酸标签亲和纯化柱(Ni-NTA树脂)纯化融合蛋白;采用间接ELISA法,检测血清中的特异性抗体,共检测35例华支睾吸虫虫卵粪检阳性血清,36例正常人血清,15例日本血吸虫、15例卫氏并殖吸虫和13例猪囊尾蚴病人血清,评价重组蛋白的免疫学诊断价值。结果发现华支睾吸虫特异性富甘氨酸2a(GRA2a)类抗原基因家族,将其中的Cs4抗原基因植入重组表达质粒pET28a(+)的NcoI位点,成功实现融合蛋白的表达,并进一步纯化得到可溶性重组蛋白。采用间接ELISA法检测血清中的特异性抗体,该ELISA法的敏感性为80.0%,特异性为97.2%,总符合率为88.7%;日本血吸虫、卫氏并殖吸虫和猪囊尾蚴病人血清的假阳性率分别为6.7%、6.7%和7.7%。经核苷酸序列同源性比较,华支睾吸虫GRA2a类抗原是迄今为止尚未进行功能研究的华支睾吸虫特异性抗原。结论发现华支睾吸虫GRA2a类抗原基因家族;成功构建重组表达质粒,并表达、纯化出可溶性重组蛋白;该抗原具有较高的免疫学诊断价值。

快速诊断疟疾胶体金免疫层析试条方法的建立与评价

目的建立一种能区分恶性疟的快速、简便诊断疟疾的胶体金免疫层析试条方法,并对其进行评价。方法筛选基于恶性疟原虫乳酸脱氢酶制备的单克隆抗体对,采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记筛选到的单克隆抗体F4H12、G4C9和D8F7,并将其吸附于样品垫;将单克隆抗体B2G10(针对恶性疟原虫与间日疟原虫)和D6A7(只针对恶性疟原虫)分别划线包被于同一硝酸纤维素膜适当位置,制成免疫层析检测试条。用该试条检测疫区非疟疾发热病人血样(107份)和内脏利什曼病患者血样(17份)以评价其特异性,检测确诊的疟疾患者血样(间日疟110份,恶性疟54份)以评价其敏感性。均用单盲法检测。结果检测107份疫区非疟疾发热病人血样和17份内脏利什曼病患者血样,有119份显示为阴性,特异性约为96.0%;其中17份内脏利什曼病患者血样全部为阴性。检测164份疟疾患者血样,阳性153份,敏感性为93.3%,其中间日疟检出率为92.7%(102/110),恶性疟检出率为94.4%(51/54)。结论研制出的快速诊断疟疾胶体金免疫层析试条敏感性、特异性均较高。

恶性疟原虫乳酸脱氢酶特异性单克隆抗体的制备

目的制备恶性疟原虫乳酸脱氢酶特异性单克隆抗体.方法克隆、表达恶性疟原虫乳酸脱氢酶基因,并以表达的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备单克隆抗体,对所制备的单克隆抗体确定其亚类和效价,蛋白质印迹法(Western blotting) 分析其特异性.结果成功克隆并表达了恶性疟原虫乳酸脱氢酶基因,以重组恶性疟原虫乳酸脱氢酶蛋白作为免疫源制备单克隆抗体,共筛选了15株能高效分泌效价在 1∶6 400～1∶51 200 特异抗体的细胞株,抗体亚类为IgG1或IgG2.所有抗体均能唯一识别恶性疟原虫虫源蛋白 Mr 33 000组分,而与疫区非疟疾发热病人的红细胞组分无交叉反应.结论以重组恶性疟原虫乳酸脱氢酶蛋白为免疫源成功制备了能识别天然恶性疟原虫乳酸脱氢酶蛋白的特异性单克隆抗体.

华支睾吸虫PPMPⅠ型抗原重组Cs2蛋白免疫诊断价值的评价

目的应用华支睾吸虫PPMPⅠ型抗原重组Cs2蛋白（rCs2）建立2种华支睾吸虫病免疫学检测方法,并进行初步评价。方法以可溶性rCs2作为诊断抗原,建立间接ELISA检测方法,并研制胶体金免疫层析检测（GICA）动力流体型试条,检测血清中的特异性抗体。采用ELISA法和GICA试条共检测35例华支睾吸虫虫卵粪检阳性患者、15例日本血吸虫病患者、15例卫氏并殖吸虫病患者和13例猪囊尾蚴病患者的血清,以及33份健康人血清。为进一步评价诊断价值,8只新西兰兔各感染600个华支睾吸虫囊蚴,随机均分为感染组和治疗组,感染第56天,治疗组各兔给予吡喹酮治疗[150 mg/（kg.d）×2 d],用ELISA法和GICA法检测两组兔0~44周抗rCs2特异性抗体的消长。结果 ELISA法的敏感性为71.4%（25/35）,特异性为93.4%（71/76）,总符合率为86.5%（96/111）,与日本血吸虫病、卫氏并殖吸虫病和猪囊尾蚴病患者血清的交叉反应阳性率分别为1/15、1/15和1/13。GICA试条检测法的敏感性为85.7%（30/35）,特异性为92.1%（70/76）,总符合率为90.1%（100/111）。经ELISA检测,感染组兔自感染后第4周抗rCs2特异性抗体水平开始上升,于第6周达到高峰,随后快速下降,至第20周已呈较低水平;治疗组的特异性抗体消长趋势同感染组,同一时点的2组实验兔的抗体水平差异无统计学意义（P〉0.05）。GICA试条检测结果表明,2组兔血清均仅在4~16周检出阳性。结论以PPMPⅠ型抗原rCs2建立的间接ELISA方法和GICA动力流体型试条对华支睾吸虫病具有较好的诊断价值。

利什曼原虫—DNA重复序列在虫种鉴定上的价值分析

目的 通过分析和比较我国利什曼原虫分离株与相应的利什曼原虫世界卫生组织(WHO)参照株在一种DNA重复序列上的同源性以考察这一DNA重复序列应用于鉴别我国利什曼原虫的价值。方法 PCR扩增各利什曼原虫分离株的DNA重复序列片段并测序,用GENEDOC软件比较扩增的各分离株DNA重复序列的同源性。结果 该DNA重复序列在种内各利什曼原虫分离株间完全同源或高度同源(99%～10 0 % ) ,且碱基变异具有高度稳定性,而在种间则显示相当的差异(一般同源性小于90 % )。结论 该DNA重复序列在我国利什曼原虫的鉴定上有较好的实用价值。

华支睾吸虫PPMP型抗原基因的克隆、表达与免疫原性鉴定

目的筛选华支睾吸虫成虫cDNA表达文库,寻找和鉴别新颖的抗原基因,并分析其重组蛋白的免疫原性方法以华支睾吸虫病患者混合血清免疫筛选华支睾吸虫成虫λZAP cDNA表达文库,将阳性噬菌体克隆、测序,对获得的核苷酸序列进行生物信息学分析。将目的基因成熟肽的编码区克隆至原核表达质粒pET28b(+),转化至大肠埃希菌BLR(DE3),异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。用组氨酸标签亲和纯化柱(Ni-NTA树脂)纯化表达产物,蛋白质印迹(Western blotting)分析其免疫原性。以纯化的重组蛋白pET28b-Cs2免疫BALB/c小鼠,制备免疫血清,ELISA检测抗体水平。结果共获得44个阳性克隆,其中3个克隆的氨基酸序列中均含有PPMP重复序列,将其命名为华支睾吸虫PPMP型抗原,将其中含有KPPMPGDRDA、QPPMPGGRDA串联重复多肽序列的抗原分别称为PPMPⅠ型和PPMPⅡ型抗原。经核苷酸序列同源性比较,PPMP型抗原是一个新的华支睾吸虫特异性抗原家族。PPMPⅠ型的Cs2基因和PPMPⅡ型的Cs3基因的成熟肽编码区在大肠埃希菌BLR(DE3)或BLR(DE3)pLysS中表达,并获得可溶性重组蛋白,2个重组蛋白的相对分子质量分别为M_r 22 000和M_r 39 000。重组蛋白可被华支睾吸虫病患者血清所识别。ELISA结果显示,免疫小鼠可产生高滴度(1:64000)特异性IgG抗体。结论发现华支睾吸虫PPMP型抗原基因家族,其重组蛋白具有较强的免疫原性。

抗杜氏和什曼原虫单克隆抗体的应用——Ⅱ.内脏利什曼病治疗前后循环抗原的检测

以抗杜庆利什曼单克隆抗体L_(12)F_7检测黑热病病人的循环抗原。文中对1986～1989年收集并低温保存的118份血清加以检测,阳性率为88.9％;另检测经锑剂治疗后的患者血清57份,结果均为阴性。同时又以IFA检测体内抗体,阳性率为68.4％。这57例治愈者经追踪观察并未出现复发及抗锑现象。因而用单克隆抗体检测循环抗原的另一优越性,可以作为疗效考核的新方法。

快速诊断疟疾的免疫层析试条的研制

开发成功了一种能快速、灵敏、高特异性检测疟疾的免疫层析试条。选自恶性疟原虫富组蛋白 一级结构中的九肽 ( AHHAHHAAD) ,经人工合成后作为免疫原 ,生产了一些单表位单抗 ;完成了一些单抗的纯化与鉴定 ;制取了金标单抗并对其吸收光谱进行了分析 ;选取了包被单抗和金标单抗间的配对 ;比较了影响检测的各种因子。当用此试条检测 62名已用常规血膜镜检法确证患有疟疾个体的全血 ,准确率达 93.54%。

应用单克隆抗体检测白蛉体内的前鞭毛体

以杜氏利什曼前鞭毛体为靶抗原的L12G9单克隆抗体(McAb),检测人工感染杜氏利什曼原虫的白蛉。当空腹雌蛉吸取病鼠血液后,分别饲养4、6、8和10d后解剖。吸血后4d,前鞭毛体较少。阳性率仅为15.9％;而10d,其感染程度较重,可获100％的阳性检出率。其阳性率与白蛉的感染程度呈正相关。另外又证明应用单克隆抗体检测时,原虫数不能低于11×10~7/ml,宜选择胃血完全消化后的白蛉,方可得到良好的效果。如捕获的白蛉,胃内前鞭毛体较少,则可经NNN基培养后,再进行检测,亦可获得同样效果。

rK39抗原应用于我国西北地区内脏利什曼病诊断的研究

目的：评价ｒＫ３９抗原诊断内脏利什曼病的价值。方法：利用利什曼原虫的类Ｋｉｎｅｓｉｎ基因中编码３９个氨基酸重组片段的表达产物ｒＫ３９为抗原，对我国甘肃、四川、新疆等部分地区的１０７名黑热病患者进行ＥＬＩＳＡ诊断。结果：血清１∶１００稀释，ｒＫ３９重组抗原的工作浓度为１∶３０００，检出的抗体阳性率为９６．２％（１０３／１０７），与原虫检出的符合率为１００％。在６５例５岁以下病人中，阳性检出率为９５．３％（６２／６５）。挑选３１名抗体阳性滴度较高者，使用ｒＫ３９的工作浓度仍为８０ｎｇ／孔，则阳性的最高滴度可达１０－３。除１例麻风病患者抗体ＯＤ＞０．４３外，２７例正常人、２０例疟疾病人、２０例血吸虫病病人及２７例结核病患者血清均无交叉反应出现。结论：用重组抗原ｒＫ３９作为黑热病诊断，在我国尚属首次，此法特异性及敏感性高，且有稳定的重复性。

恶性疟原虫单表位单抗的建立及鉴定

目的： 研制恶性疟原虫单表位单抗。方法： 根据蛋白质结构理论， 选取能代表恶性疟原虫蛋白质抗原性的ＨＲＰ－ＩＩ肽段， 长度为６～９ 个氨基酸， 经人工合成， 通过毛细管电泳， 确定其纯度后， 对ＢＡＬＢ／ｃ小鼠进行免疫。结果： 应用脾脏埋植法和杂交瘤技术， 获得４ 株针对恶性疟原虫ＨＲＰ－ＩＩ单一表位的杂交瘤细胞。结论： 首次报告直接用合成ＨＲＰ－ＩＩ肽段制备针对该蛋白质的单表位单抗的方法获得成功。

新疆北部荒漠地区继续检获都兰利什曼原虫

在新疆克拉玛依地区，从大沙鼠体内查见都兰利什曼原虫（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａｔｕｒａｎｉｃａ）后［１］，我们又先后在新疆准噶尔盆地东缘的奇台县和阜康县进行调查，共捕大沙鼠２４只，从其耳组织分离获得９株利什曼原虫，又在鼠洞口安装捕蛉器，从蒙古白蛉（Ｐｈｌｅ...

抗体差异度法推测血吸虫病患者感染时间的探讨

目的探讨抗体差异度法推测血吸虫病患者感染时间的可行性。方法检测小鼠和急性血吸虫病患者血清中的IgM、IgG抗体水平，并分别计算抗体差异度值，推测急性血吸虫病患者的感染时间；通过循环抗原检测和免疫印迹反应验证急性血吸虫病患者的感染情况，并与现场流行病学调查资料相比对。结果经抗体差异度值分组的急性血吸虫病患者的感染时间明显不同，差异度值大于0．61的患者感染时间约为4-5周，而小于0．61的患者感染时间在7-8周以上。结论抗体差异度法在推测急性日本血吸虫病患者的感染时间方面具有可行性。

克拉玛依地区的利什曼病 Ⅸ.白蛉自然感染前鞭毛体的鉴定

本文报道新疆克拉玛依地区的大沙鼠洞、旷野及人房等不同场所内白蛉自然感染利什曼原虫的情况、蛉体内原虫对实验动物的致病特征以及用利什曼原虫McAb的dot-ELISA法对白蛉自然感染的利什曼前鞭毛体的检测结果;并结合4年来对当地白蛉的生态和大沙鼠体内的利什曼原虫对白蛉的感染性等一系列的调查研究,证实蒙古白蛉和安氏白蛉为克拉玛依大沙鼠体内利什曼原虫的传播媒介。

恶性疟原虫现场样品HRP-Ⅱ基因部分序列分析

目的 分析和比较不同地理株恶性疟原虫现场样品及我国恶性疟原虫现场样品与实验室培养虫株在HRP Ⅱ基因上的多态性。 方法 分别以在中国感染的恶性疟病人和在非洲感染的恶性疟病人全血为材料 ,PCR扩增HRP Ⅱ基因片段 ,扩增的产物分别克隆于 pUCm T载体并进行测序 ,用GENEDOC软件比较分析核苷酸序列及其推导的氨基酸序列的同源性。 结果 从中国海南省和云南省恶性疟病人血样中扩增出序列和长度完全相同的片段 ,大小为44 7bp ;从在非洲感染的恶性疟病人血样中扩增出 813bp的片段 ;中国恶性疟原虫实验室培养株相应核苷酸序列长度为870bp。从中国恶性疟病人血样扩增出的HRP Ⅱ基因片段序列与从非洲恶性疟病人血样扩增出的HRP Ⅱ基因片段序列及我国恶性疟原虫培养株相应的核苷酸序列相比 ,不但有多个长短不等序列的缺失和插入 ,还有多个碱基发生了突变 ;比较推导的氨基酸序列 ,除了有多个长短不等氨基酸序列的缺失和插入外 ,其他氨基酸残基没有发生改变。 结论 恶性疟原虫HRP Ⅱ基因在不同地理株间存在差异 ,在同一地理株的实验室培养株与现场样品间也存在差异 。