hSulf-1基因腺病毒表达载体的构建及其对血管内皮细胞增殖、迁移能力的影响

目的构建携带人硫酸酯酶1基因(hSulf-1)的腺病毒载体,研究其对于人脐静脉内皮细胞ECV-304增殖、迁移能力的影响。方法通过基因操作技术将hSulf-1基因插入到腺病毒基因组中,构建重组腺病毒Ad5-hSulf1;应用蛋白质免疫印迹法检测hSulf-1蛋白在ECV-304细胞中的表达及细胞内磷酸化Akt、ERK的表达变化;MTT实验检测hSulf-1过表达对于ECV-304细胞增殖的影响;采用划痕实验研究hSulf-1过表达对于ECV-304细胞迁移的影响。结果成功构建携带目的基因hSulf-1的腺病毒载体;免疫印迹结果表明hSulf1基因过表达会下调ECV-304细胞Akt和ERK信号分子的磷酸化水平;细胞增殖实验结果表明hSulf1基因过表达抑制了ECV-304细胞增殖,感染复数为50、100时细胞存活率下降至(68.49±0.05)%以及(67.78±0.06)%(P<0.05);划痕实验结果表明hSulf1基因过表达能够抑制细胞的迁移,相比于对照组细胞迁移能力减弱(P<0.01)。结论重组腺病毒Ad5-hSulf1介导的hSulf-1基因在ECV-304细胞中的过表达明显抑制细胞增殖及迁移,为hSulf-1用于肿瘤及血管生长相关疾病的基因治疗奠定了基础。

hSulf-1过表达提高乳腺癌MCF-7细胞对PARP抑制剂AZD2281的敏感性

目的:探讨人硫酸酯酶-1(human sulfatase 1,hSulf-1)基因过表达是否提高乳腺癌MCF-7细胞对PARP抑制剂AZD2281的敏感性。方法:采用不同浓度AZD2281处理细胞,并筛选AZD2281处理的最佳浓度。将携hSulf-1基因的重组腺病毒Ad5-hSulf1感染MCF-7细胞,以Ad-hSulf1和AZD2281单独或联合处理MCF-7细胞,以Ad5-EGFP处理为对照。采用流式细胞术检测细胞周期,克隆形成实验检测细胞克隆形成率,Western blotting检测细胞周期蛋白依赖性激酶4(cyclin dependent kinase 4,CDK4)及磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B,p-AKT)的表达,Transwell法、MTT法分别检测细胞的迁移及增殖。结果:AZD2281浓度为7μmol/L时对MCF-7细胞的抑制作用趋于峰值,用于后续实验。Ad5-hSulf1+AZD2281联合处理与AZD2281单独处理相比,MCF-7细胞的G2/M期细胞比例明显增多[(22.15±0.17)%vs(17.44±0.57)%,P<0.01],细胞克隆形成率[(21.43±1.52)%vs(49.43±1.44)%,P<0.01]及细胞周期蛋白CDK4的表达[(0.67±0.02)vs(0.72±0.02),P<0.05]、AKT的磷酸化水平[(0.17±0.003)vs(0.42±0.02),P<0.01]均明显降低,同时细胞的增殖率和迁移能力也有明显下降[(57.69±4.83)%vs(79.35±5.44)%;(10.33±1.53)个vs(50.67±2.31)个,均P<0.01]。结论:hSulf-1过表达可明显提高乳腺癌细胞MCF-7对AZD2281的化疗敏感性,阻滞细胞周期于G2/M期,并更明显地抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移能力,这一效应可能是通过调节细胞周期蛋白CDK4及AKT通路产生的。

细胞微环境microRNAs在肿瘤侵袭转移中的作用

肿瘤微环境是肿瘤发生、发展的重要组成成分,微环境中microRNAs作为原癌基因或抑癌基因能够进入靶细胞,调控相关靶基因的表达和功能,从而影响微环境的构成,并在肿瘤细胞侵袭和转移中发挥重要作用。因此,microRNAs在肿瘤诊断治疗中具有诱人的应用前景。

全自动Idylla^(TM)系统在中国结直肠癌微卫星不稳定性检测中的可行性研究

背景与目的:微卫星不稳定性(microsatellite instability,MSI)与错配修复(mismatch repair,MMR)基因缺陷,作为结直肠癌(colorectal cancer,CRC)等泛肿瘤免疫治疗的重要生物标志物之一,其检测近年来备受关注。目前临床上常用的多重荧光聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)检测MSI的传统方法(如Promega等),通常需要非肿瘤组织对照及较长的检测周期。Idylla^(TM)系统作为一种全自动定量PCR装置,检测MSI无需非肿瘤组织对照,且运行时间仅为2.5 h,具有较好的临床应用前景。但在国内临床应用前,应在中国CRC患者中验证该方法的可靠性。方法:收集2017年3月—2019年3月复旦大学附属肿瘤医院的87例CRC患者用40%甲醛溶液固定石蜡包埋(formalin-fixed paraffin-embedded,FFPE)的组织样本,分别采用免疫组织化学(immunochemistry,IHC)、传统PCR(Promega)和Idylla^(TM)3种方法进行MMR/MSI检测并比较分析,评估Idylla^(TM)系统临床检测的灵敏度和特异度以及在不同肿瘤含量样本中的可重复性。结果:87例CRC患者中,IHC和Promega的检测结果完全一致,其中56例被判定为MMR缺陷(deficient MMR,dMMR)/高度MSI(MSI-high,MSI-H),31例为MMR完整(proficient MMR,pMMR)/微卫星稳定(microsatellite stable,MSS)。然而,其中4例dMMR/MSI-H患者被Idylla^(TM)MSI系统诊断为MSS,1例pMMR/MSS患者被诊断为MSI-H。若以IHC/Promega为参考标准,Idylla^(TM)MSI系统的诊断灵敏度为92.9%(52/56),特异度为96.8%(30/31),总体一致率达94.3%(82/87)。随后,应用Idylla^(TM)系统对上述不一致的5例患者进行重复检测,其中4例肿瘤含量≥20%的病例检测结果与IHC/Promega MSI检测一致,但1例肿瘤含量仅为5%的病例仍与IHC/Promega不一致,被误诊为MSS。最后,针对该病例,通过激光捕获显微切割技术对肿瘤细胞进行富集后,应用Idylla^(TM)MSI系统再次检测,结果显示为MSI-H。此外,选取5例具有不同肿瘤含量(20%~60%)的病例,分别进行3次重复性验证,结果显示,Idylla^(TM)系统具有高度可重复性。结论:对于肿瘤含量≥20%的CRC患者,Idylla^(TM)系统可以为临床MSI检测提供一种快速、可靠、全自动的解决方案,并具有较高的灵敏度、特异度和可重复性。

MiR-21通过AKT/ERK途径对肝癌BEL-7402细胞增殖和迁移的影响

目的:探讨微小RNA-21(microRNA-21,miR-21)对人肝癌BEL-7402细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其可能的作用机制。方法:将携带增强型绿色荧光蛋白(enhanced green luorescent protein,EGFP)基因的miR-21表达载体pGL3-miR21-EGFP瞬时转染BEL-7402细胞,实时荧光定量-PCR检测细胞中miR-21的表达水平,蛋白质印迹法检测细胞中磷酸化蛋白激酶B[phospho-protein kinase B,p-PKB(又称p-AKT)]、磷酸化细胞外信号调节激酶(phospho-extracellular signal-regulated kinase,p-ERK)的表达,MTT法检测miR-21过表达对BEL-7402细胞增殖的影响,细胞划痕和Transwell小室法检测miR-21过表达对BEL-7402细胞迁移和侵袭能力的影响。将pGenesil-shAKT载体转染BEL-7402细胞,实时荧光定量PCR检测细胞中miR-21的表达,蛋白质印迹法检测细胞中AKT和p-AKT的表达水平,MTT法和细胞划痕实验检测pGenesil-shAKT对BEL-7402细胞增殖和迁移的影响。结果:与空白对照组(未转染质粒的BEL-7402细胞)相比,pGL3-miR21-EGFP转染后,BEL-7402细胞中miR-21的表达水平明显上调(P<0.01),p-AKT和p-ERK的表达水平同时上调(P<0.05);与空白对照组相比,miR-21的过表达明显促进了BEL-7402细胞的增殖、迁移和侵袭的能力(P<0.05)。pGenesil-shAKT转染BEL-7402细胞后,伴随着AKT和p-AKT表达水平的下调,细胞的增殖和迁移能力均明显下降(P<0.05),而细胞中miR-21的表达水平无明显变化。结论:MiR-21可能通过AKT/ERK信号通路促进BEL-7402细胞的增殖和迁移。

子宫外伴JAZF1-BCORL1基因融合的高级别子宫内膜间质肉瘤1例

报道1例发生于直肠及乙状结肠系膜的伴有JAZF1-BCORL1基因融合的高级别子宫内膜间质肉瘤,继发于异位的子宫内膜。本例发病部位罕见、形态特殊、分子改变罕见,容易误诊。