基于CRISPR-Cas9技术构建小鼠胚胎干细胞双荧光标记细胞系

目的构建p53-EGFP、Nanog-mcherry双荧光标记细胞系,对小鼠胚胎干细胞内p53、Nanog蛋白表达水平进行实时、定量追踪。在此基础上,初步探讨p53在小鼠胚胎干细胞中的作用。方法利用CRISPR-Cas9基因敲入系统分别将外源荧光蛋白表达基因插入到p53、Nanog基因组终止密码子后方,实现p53-EGFP、Nanog-mcherry融合表达。通过荧光强度分析,克隆形成能力检测等方法探索p53在小鼠胚胎干细胞中的作用。结果本研究成功构建了小鼠胚胎干细胞p53-EGFP、Nanog-mcherry双荧光标记细胞系,进一步发现p53蛋白表达在小鼠胚胎干细胞间具有异质性,且能调控Nanog蛋白表达的异质性。此外,p53蛋白表达量与小鼠胚胎干细胞克隆形成能力有关。结论基于CRISPR-Cas9基因敲入技术构建的双荧光标记细胞系中荧光强度的变化可以在活细胞状态下代表小鼠胚胎干细胞内相应蛋白表达水平,p53可通过其在小鼠胚胎干细胞群体间异质性表达参与小鼠胚胎干细胞转录调控网络中,并一定程度影响其自我更新能力。