马家柚果实常温贮藏期间柠檬酸含量变化及相关基因的表达分析

【目的】明确江西省特色品种马家柚果实贮藏期间有机酸含量的变化规律及柠檬酸积累调控相关基因的表达特征,为筛选出调控贮藏早期柠檬酸含量显著增加的关键基因以及提高贮藏品质提供理论依据。【方法】以贮藏0~150 d的马家柚果实为试材,采用高效液相色谱法(HPLC)测定果实内有机酸的含量,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术测定柠檬酸合成、转运和降解相关基因的相对表达量。【结果】马家柚果实有机酸含量在贮藏初期(0~40 d)显著上升,并在贮藏40 d时达到最大值,贮藏40~70 d时下降,贮藏70~80 d短暂上升后直至贮藏结束没有明显变化。柠檬酸为果实中最主要的有机酸,且其变化趋势与有机酸变化动态基本一致,而苹果酸、奎宁酸、酒石酸含量极低,并在整个贮藏期变化不明显。对柠檬酸含量显著变化的贮藏期(0~70 d)进行柠檬酸积累调控相关基因的表达分析,发现合成基因CmPEPC1和CmCS1/2表达量在贮藏0~40 d增加,CmPEPC1/2和CmCS2在贮藏40~70 d减少;转运基因CmVHAc4表达量呈先上升(贮藏0~40 d)后下降(贮藏40~70 d)的趋势,而CmVHP2只在贮藏40~70 d显著下降,CmDIC的变化趋势与二者相反,在贮藏0~40 d逐渐下降。降解基因CmGS2和CmGAD5在贮藏0~40 d期间表达量逐渐减少。【结论】马家柚果实有机酸含量在贮藏期间主要受柠檬酸含量变化的影响,贮藏早期柠檬酸含量显著变化可能受其合成(CmPEPC1/2、CmCS1/2)、转运(CmDIC、CmVHP2、CmVHA-c4)和降解(CmGS2、CmGAD5)相关基因的共同调控。

赤霉素及二氢茉莉酸丙酯对抑制温州蜜柑果实浮皮的影响

为探究抑制果实浮皮的方法及赤霉素(GA_(3))与二氢茉莉酸丙酯(PDJ)抑制浮皮发生的机制,本研究以完熟栽培温州蜜柑宫川为试验材料,通过喷施钙或GA_(3)与PDJ,研究其对果实浮皮指数以及果实品质的影响,并分析GA_(3)与PDJ处理后果皮的细胞壁结构、细胞壁物质含量、相关水解酶活性、果皮激素含量及相关基因表达量的变化。结果表明,各处理均能降低果实浮皮指数,其中采前喷施2次GA_(3)和PDJ后果实浮皮指数始终维持在较低水平,且该处理条件下果实外观及内在品质无明显变化。同时,GA_(3)与PDJ处理下调了CitCx、CitPME等基因表达量,降低了果胶酯酶(PME)和纤维素酶(Cx)的活性,提高了果皮中原果胶和半纤维素含量,延缓了纤维素含量下降并增加了果实硬度,并且降低了果皮细胞膜脂过氧化程度。喷施GA_(3)与PDJ后果皮中乙烯合成量下降而生长素含量上升,CitACO基因表达下调,而CitETR1及CitIAA27表达上调。综上,采前喷施2次GA_(3)与PDJ是防治完熟栽培温州蜜柑浮皮的最佳方法。GA_(3)与PDJ通过抑制细胞壁结构物质降解,降低膜脂过氧化程度,同时抑制乙烯合成并降低果皮细胞对乙烯的敏感性,提高果皮生长素(IAA)含量并抑制果皮衰老,从而抑制浮皮的发生。本研究结果为开发控制浮皮技术及揭示柑橘果实浮皮发生机制提供了实践与理论参考。

不同套袋处理对金沙柚果实品质的影响

【目的】果实套袋是果品优质生产的重要栽培技术措施。研究不同套袋处理对金沙柚果实品质的影响,旨在优化金沙柚套袋方案,提升果实品质。【方法】采用8年生金沙柚为试验材料,以不套袋为对照,采用5种不同套袋时间、6种不同纸袋类型、3种不同摘袋时间,通过比较果实内外在品质,并结合第二年重复试验获得最佳套袋方案。【结果】双层和三层套袋处理果实的果皮a^(*)值、CCI值显著高于单层纸袋处理和不套袋处理,h^(*)值则与其结果相反;与不套袋相比,不同纸袋套袋处理总类胡萝卜素均显著下降,总叶绿素只在双层和三层纸袋中的合成受到抑制;双层和三层的纸袋处理果皮总类胡萝卜素/总叶绿素比值显著高于单层纸袋处理果皮;双层纸袋套袋处理相比其他纸袋类型的果实既保持良好外观又具有优质的内在品质。过早套袋(6月15日)会导致果实外观品质(a^(*)值和CCI值)和内在品质(可溶性固形物、总糖、Vc、可滴定酸)下降,不同时间套袋果实总叶绿素和总类胡萝卜素含量无显著差异。随着套袋时间的推迟,糖酸比和固酸比呈现逐渐增加的趋势。提前摘袋可提高b^(*)值、CCI值和类胡萝卜含量/叶绿素含量比值,但提前摘袋的果实向阳面会明显黄于果实背阳面,存在明显色泽不均匀情况;提前摘除纸袋后期恢复光照处理,果皮总叶绿素含量显著下降,并且提前15 d果实叶绿素含量显著低于提前30 d摘除纸袋;除总糖外,其他内在品质与不提前摘袋处理差异不显著。此外,综合不同套袋处理结果获得最佳套袋方案与第二年重复试验结果一致。【结论】不同套袋时期、摘袋时期及不同纸袋类型处理均会影响金沙柚果实品质,其中双层纸袋套袋处理较好,且套袋及摘袋时间均不宜过早。确定于7月5日套双层外红内黑纸袋、于成熟时带袋采收为金沙柚最佳套袋方案,该研究对于金沙柚果实高品质栽培技术具有理论与实践指导意义。

柑橘抗逆基因MYB96的克隆与表达分析

为了探讨柑橘MYB96基因在柑橘抗逆过程中的作用,以甜橙、柠檬、金柑、芦柑为试验材料,克隆得到4个柑橘MYB转录因子家族基因,分别命名为CsMYB96、ClMYB96、FmMYB96、CrMYB96,并对其生物信息学以及不同非生物胁迫处理下的表达模式进行分析。结果表明,CsMYB96、ClMYB96、FmMYB96和CrMYB96的开放阅读框长度分别为1032,1035,1035和1032 bp,其编码的蛋白分别由343,344,344,343个氨基酸组成,分子量分别约为38.16,38.27,38.22,38.13 ku,等电点分别为6.31,6.35,6.35,6.31,均为不稳定亲水性蛋白;亚细胞定位预测结果均定位于细胞核。这4个基因编码的蛋白二级结构相似,主要由α螺旋和无规卷曲构成;具有高度保守的R2和R3结构域;在进化关系上,与克莱门氏小柑橘CcMYB96亲缘关系最近。CsMYB96基因的启动子中含有脱落酸响应元件(ABRE)、低温响应元件(LTR)、厌氧响应元件(ARE)、参与干旱诱导的MYB结合位点(MBS)等非生物胁迫响应相关顺式作用元件。qRT-PCR结果分析表明,甜橙CsMYB96能被低温和干旱胁迫诱导表达;柠檬ClMYB96和金柑FmMYB96在高盐胁迫下被诱导表达;而芦柑CrMYB96的表达量在低温、干旱和高盐胁迫下都有不同程度的下调表达。

茶叶多酚氧化酶三相分离纯化及酶学性质研究

为研究一种快速高效的茶叶多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)制备方法,本试验采用三相分离法(three phase partitioning,TPP)获取茶叶PPO,并研究其酶学特性。结果表明,通过两次三相分离纯化后可获得酶比活力210.46 U/mg、纯化15.76倍、回收率8.04%的茶叶PPO,其最亲和底物为邻苯三酚(K_(m)=6.82 mmol/L,V_(max)=5.36×10^(−2) OD/min),最适反应温度和pH分别为45℃和pH5.5,在25℃和pH4.5~7.0时具有较好的稳定性。对纯化后茶叶PPO抑制作用最显著的化合物为抗坏血酸(IC_(50)=2.42±0.18 mmol/L),其次是草酸和EDTA,柠檬酸抑制效果最弱,而卤化物无显著影响(P>0.05)。表明三相分离法能够较好的保留茶叶PPO活性,且操作简便、耗时短、成本低,有利于工业化应用。

柑橘抗逆基因WRKY75的克隆与表达分析

【目的】低温、干旱、高盐等非生物胁迫严重限制柑橘的生长发育和地理分布。转录因子可以调控下游抗逆基因表达,在植物响应非生物胁迫的过程中起了重要的作用。WRKY是植物中重要的转录因子家族之一,其家族成员在植物抗逆过程中起着重要的作用。为研究WRKY转录因子在柑橘抗逆中的功能。【方法】以柠檬[Citrus limon(L.)Burm.f.]、甜橙[Citrus sinensis(L.)Osbeck.]、金柑[Fortunella margarita(Lour.)Swingle.]和芦柑[Citrus reticulata Blanco.]等柑橘品种的实生苗为试验材料,通过电子克隆和RT-PCR的方法从4种材料中克隆到4个新的WRKY家族基因,分别命名为ClWRKY75、CsWRKY75、FmWRKY75、CrWRKY75,并对其进行生物信息学和不同组织及胁迫处理下的表达模式分析。【结果】生物信息学分析结果显示ClWRKY75、CsWRKY75、FmWRKY75和CrWRKY75的cDNA序列全长分别为702,702,705,705 bp,分别含有582,582,585,585 bp的开放阅读框(Open reading frame,ORF),分别编码193,193,194,194个氨基酸;推测其蛋白分子质量分别为21.73、21.67、21.80和21.80 ku,等电点分别是9.33、9.25、9.25和9.25,且均含有WRKY家族的保守结构域(1个WRKY结构域和1个C2H2型锌指结构域)。多序列比对发现,ClWRKY75、CsWRKY75、FmWRKY75和CrWRKY75蛋白与克莱门柚CcWRKY75、苹果MdWRKY75、可可TcWRKY75和葡萄VvWRKY75同源性高于90%。系统进化树分析结果表明,ClWRKY75、CsWRKY75、FmWRKY75和Cr WRKY75与克莱门柚CcWRKY75的亲缘关系最近,与烟草NtWRKY75的亲缘关系较远。亚细胞定位预测结果表明,ClWRKY75、CsWRKY75、FmWRKY75和CrWRKY75蛋白均定位于细胞核。蛋白二级结构预测结果显示,4种WRKY75蛋白含无规则卷曲结构39.18%~52.33%,α-螺旋结构29.02%~35.05%,延伸链结构10.36%~13.92%,β-转角结构8.29%~11.86%。实时荧光定量PCR(Realtime quantitative PCR,qPCR)分析显示,4℃低温处理能提高4个柑橘WRKY75基因表达。而20%PEG6000模拟干旱处理只能提高FmWRKY75和CrWRKY75表达量。250 mmol/L NaCl胁迫处理只能提高CsWRKY75和FmWRKY75表达量。【结论】结果表明柠檬ClWRKY75、甜橙CsWRKY75、金桔FmWRKY75和芦柑CrWRKY75是WRKY基因家族的成员,且受多种非生物胁迫诱导表达,推测其可能在柑橘响应非生物胁迫过程中发挥了重要作用,该研究结果为进一步研究柑橘抗逆的分子机制提供理论参考。

温州蜜柑完熟栽培期间果实糖酸变化及其相关基因表达分析

【目的】明确温州蜜柑在设施完熟栽培过程中果实糖酸含量的变化规律及其与相关基因表达的关系,揭示其果实品质提升的分子机理。【方法】以温州蜜柑‘宫川’品种为材料,测定完熟栽培期间不同时间果实糖酸含量,并通过荧光定量PCR技术分析果肉中糖及柠檬酸代谢相关基因相对表达量变化,最后对糖酸含量变化与相关代谢基因表达量进行相关性分析。【结果】温州蜜柑果实在设施完熟栽培期间可滴定酸含量不断下降,而可溶性糖含量在花后260 d之前持续增加,之后缓慢下降。高效液相色谱(HPLC)法分析表明蔗糖在果肉所有糖中含量最高,其次分别为果糖和葡萄糖;有机酸则以柠檬酸为主,其含量变化决定总有机酸的含量。糖合成相关基因CitSPSs和CitSUSs相对表达量总体上呈上升趋势,其中CitSUS3及CitSUS4与总糖含量分别呈显著正相关,而CitSPS1、CitSPS2、CitSUS1以及CitSUS6基因表达量与总糖含量变化虽然呈正相关关系但不显著;柠檬酸合成基因CitPEPC和CitCS整体上也呈上升趋势,而相关性分析表明其表达量与柠檬酸含量呈不显著负相关关系;柠檬酸降解基因CitACO3和CitGAD4表达量在完熟栽培过程中均呈上升趋势,且与柠檬酸含量呈显著负相关关系,而CitGS2表达量变化波动较大,与柠檬酸含量相关关系弱。【结论】温州蜜柑果实在设施完熟栽培期间总糖含量不断提高,有机酸含量不断下降,蔗糖含量决定总糖含量,而有机酸含量则由柠檬酸决定;在完熟栽培期间果肉中糖的积累主要由CitSUS3和CitSUS4基因的表达决定,而柠檬酸含量的下降主要由降解基因CitACO3和CitGAD4的上调表达来决定,而与合成基因的表达无直接关联,因此认为完熟栽培期间柠檬酸的降解可能主要通过GABA途径进行。该研究明确了设施完熟栽培的温州蜜柑果实中糖酸积累的变化规律及与相关基因表达的关系,为揭示完熟栽培温州蜜柑果实品质提升的分子机制提供一定的理论基础。

柑橘胁迫响应基因WRKY47的克隆与表达分析

以柠檬[Citrus limon(L.)Burm.f.]、甜橙[Citrus sinensis(L.)Osbeck]、芦柑(Citrus reticulata Blanco)、金柑[Fortunella japonica(Thunb.)Swingle]为试验材料,基于甜橙基因组数据库中的甜橙基因碱基序列,利用RT-PCR方法克隆获得4个WRKY家族基因ClWRKY47、CsWRKY47、CrWRKY47和FjWRKY47的cDNA全长碱基序列。序列分析结果表明,这4个基因的cDNA全长都是1567 bp,开放阅读框为1506 bp,编码501个氨基酸。氨基酸序列和结构分析结果显示,这4个基因编码的蛋白质属于Group IIa+IIb类WRKY蛋白。进化树分析结果显示,所克隆的4个柑橘WRKY蛋白与克莱门柚WRKY47蛋白的亲缘关系最近。对CsWRKY47启动子顺式作用元件预测分析,发现CsWRKY47启动子包含脱落酸响应元件(ABRE)、茉莉酸甲酯响应元件(CGTCA-motiF)、抗氧化响应元件(ARE)、参与干旱诱导的MYB结合位点(MBS)等多个与胁迫相关的顺式作用元件。实时荧光定量表达分析结果表明,柠檬ClWRKY47和甜橙CsWRKY47能被高盐、干旱、低温胁迫诱导表达;芦柑CrWRKY47在干旱和低温胁迫下诱导表达,高盐胁迫下表达量下调;金柑FjWRKY47在高盐胁迫下诱导表达,干旱和低温胁迫下下调表达。为进一步开展柑橘胁迫相关基因WRKY47的功能鉴定奠定了基础。

‘马家柚’果实发育期有机酸含量变化及柠檬酸代谢相关基因的表达分析

【目的】明确江西省地方特色品种‘马家柚’果实发育期有机酸的变化规律及其与柠檬酸相关基因表达量的关系,揭示‘马家柚’果实品质形成的分子机制。【方法】研究以‘马家柚’发育期果实为材料,应用高效液相色谱技术(HPLC)测定花后60~210 d果实中有机酸组分及含量,以及通过荧光定量PCR分析柠檬酸合成、转运和降解相关基因表达量的变化,分析柠檬酸变化规律与相关基因表达量的联系。【结果】‘马家柚’果实发育期有机酸呈先上升后下降的趋势,柠檬酸含量占总有机酸的45.51%~81.47%,且其变化趋势与有机酸变化趋势一致。在整个果实发育期柠檬酸合成基因CmPEPC1、CmPEPC2、CmCS1和CmCS2相对表达量变化与柠檬酸含量变化趋势不同;柠檬酸运输相关基因CmCHX和CmVHP2表达量的变化与柠檬酸积累趋势也不一致,但CmDIC基因在果实发育前期的下调表达促进了柠檬酸的快速积累,同时CmVHA-c4的表达与柠檬酸积累密切相关;与降解相关的CmGS2和CmACLβ1基因均在柠檬酸快速增长期时开始下调表达,但在果实成熟期柠檬酸含量下降时表达量变化不大。同时CmAco3、CmGAD5和CmGABA-T均在花后210 d果实成熟期柠檬酸含量下降时表达量达到最高并且显著高于花后195 d。【结论】‘马家柚’果实有机酸在果实膨大期持续上升,而在成熟期后开始下降,并且有机酸的含量及变化趋势均由柠檬酸决定。柠檬酸的积累不受柠檬酸合成相关基因表达的直接影响,而是由柠檬酸转运载体基因以及降解基因的表达决定。在果实发育前中期,柠檬酸的积累主要受CmDIC、CmVHAc4、CmGS2以及CmACLβ1基因的调控,其降解主要通过谷氨酰胺和乙酰辅酶A途径进行,而在果实发育后期柠檬酸的积累在受CmVHA-c4基因调控的同时也受CmAco3、CmGAD5和CmGABA-T的调控,其降解主要通过GABA途径进行。

透湿性反光膜对柑橘果皮蜡质晶体结构和组成成分的影响

以12年生枳砧宫川温州蜜柑为试验材料,在果实膨大期覆盖透湿性反光膜,研究其对土壤含水量、冠层光照特征、果实色泽、果皮蜡质晶体结构和成分等的影响。结果表明,覆盖透湿性反光膜可以有效地维持土壤水分。柑橘树冠层的地表反射光光照度、光合指标(P、T、G)、色差指数(L~*、a~*、b~*、c~*和CCI)显著提高。覆盖透湿性反光膜后的果皮蜡质排列紧密、分布均匀,蜡质晶体似乎与无定型蜡质结构融合并明显减少。透湿性反光膜处理后果皮蜡质总量、蜡质组分脂肪酸和烷烃含量变化不大,醇类含量有所上升但不显著,而醛类含量极显著下降,各组分占总量比例大小顺序为烷烃(35.19%)>脂肪酸(34.60%)>醇(18.57%)>醛(11.64%)。蜡质组分含量测定结果显示:C20脂肪酸在透湿性反光膜覆盖处理后显著下降,烷烃组分含量在覆盖处理后无显著变化;C28醛在透湿性反光膜处理后相比于对照极显著下降,是引起总醛减少的主要原因;C28醇在透湿性反光膜处理后极显著上升,C32醇含量显著下降。综上所述,透湿性反光膜的铺设引起了宫川温州蜜柑光照环境的改变和光合能力的提升,使得果皮蜡质晶体数量和结构以及蜡质组分含量发生变化,从而对果实外观品质的提高起到了积极作用,推测蜡质组分中C28醛含量显著下降可能与晶体减少以及透湿性反光膜覆盖有关。

柚CmWOX2基因克隆及在胚发育过程中的表达分析

【目的】克隆马家柚[Citrus maxima(L.)Osbeck‘Majiayou’]WOX2基因,探讨CmWOX2基因在柚种子发育过程中的调控作用。【方法】使用PCR技术克隆柚CmWOX2基因,对其进行生物信息学分析,通过qRT-PCR技术比较、分析经花粉辐射处理后授粉获得的退化种子和正常果实中饱满种子中的CmWOX2基因在不同发育时期的表达情况。【结果】CmWOX2基因cDNA序列长度为1177 bp,序列同源性分析结果表明,柚CmWOX2基因与其他物种WOX2基因在5’homeobox区域具有高度相似性,在3’WUS-box区域有部分差异。实时荧光定量qRT-PCR结果表明,CmWOX2基因在马家柚的幼苗根、茎、叶中相对表达量较低,在种子中的相对表达量较高;CmWOX2基因在未受精的子房中也出现表达,受精后在马家柚胚的发育过程中(授粉后0~10周)相对表达量持续增加,之后随种子成熟,相对表达量逐渐下降;无核果实中的退化种子CmWOX2基因的相对表达量明显低于正常果实中的饱满种子。【结论】CmWOX2基因在马家柚胚胎的形成发育过程中发挥着至关重要的作用,并且通过花粉辐射获得的无核果实中CmWOX2基因相对表达量下降与胚发育异常密切相关。

越冬前北京和云南葡萄溃疡病组织内相关真菌的鉴定

为了解我国不同地区在冬季修剪窗口期葡萄枝干组织中与葡萄溃疡病相关的病原微生物的种类,探索葡萄溃疡病组织中病原微生物的年周期变化,从栽培和植保角度制定防控措施,采用微生物分离、生物学特性观察,以及ITS测序的方法,对北京和云南葡萄溃疡病组织内相关真菌进行分离和鉴定。从北京的材料中分离鉴定出5种真菌:45.0%葡萄座腔菌属(Botryosphaeria),30.0%镰刀菌属(Fusarium),15.0%刺盘孢属(Colletotrichum),7.5%木霉属(Trichoderma),2.5%茎点霉属(Phoma);从云南的材料中分离鉴定出7种真菌,32.0%茎点霉(Phoma),27.0%壳囊孢属(Cytospora),14.0%拟茎点霉属(Phomopsis),14.0%葡萄座腔菌属(Botryosphaeria),4.5%附球菌属(Epicoccum),4.5%镰刀菌(Fusarium),4.5%链格孢属(Alternaria)。研究结果首次揭示出北京和云南葡萄越冬前溃疡病组织具有多种植物病原微生物共同存在的特征及主要相关真菌的种类。

在葡萄果实发育Ⅰ、Ⅲ期差异表达的SWEET基因家族成员的生物信息学分析

为探索SWEET基因家族在葡萄果实发育中的表达与功能,以本实验室完成的酿酒葡萄品种赤霞珠Ⅰ期和Ⅲ期果实的转录组数据为基础,筛选出在Ⅰ期和Ⅲ期表达量存在显著差异的9个SWEET基因家族成员,利用生物信息学工具,对这9个基因的基因结构、蛋白的基本理化性质、二级结构、亚细胞定位、保守基序和序列同源性等进行预测分析,并利用实时荧光定量PCR(qPCR)技术对分析结果进行验证。基因组定位结果发现这9个SWEET基因分布在7条染色体上,蛋白序列可分成4个亚族。不同成员间氨基酸数目、氨基酸序列间的疏水性存在一定的差异;二级结构预测结果显示,这9个SWEET基因的氨基酸序列以α-螺旋和无规则卷曲为主要组成部分;基因结构分析表明,除VvSWEET4含有4个内含子,其余8个均含有5个内含子;对9个SWEET基因家族成员蛋白的亚细胞定位预测分析表明:它们大多定位在质膜、叶绿体类囊体膜和液泡膜上;QPCR结果表明,在Ⅰ期和Ⅲ期差异表达的9个SWEET基因家族成员中,5个基因上调表达,4个基因下调表达,与转录组分析结果一致。