mkl基因在海分枝杆菌抵抗宿主免疫中的作用

本研究利用MycoMarT7噬菌体建立了海分枝杆菌随机突变库,鉴定获得1株转座子插在基因MMAR_0994(mkl)上的突变株。用野生株和突变株分别感染斑马鱼成鱼,通过观察斑马鱼的存活情况,研究mkl基因对海分枝杆菌毒力的影响;利用尾静脉注射感染孵出48h后的斑马鱼幼鱼,于荧光显微镜下观察突变株及野生株在幼鱼体内的播散情况,以检测mkl基因在细菌与宿主天然免疫相互作用中的功能;将野生株和突变株分别感染小鼠来源巨噬细胞,检测其在巨噬细胞内的增殖。此外,还检测了突变株对酸性环境的耐受情况。结果显示,mkl基因突变株感染斑马鱼成鱼后25d内没有鱼死亡;在斑马鱼幼鱼感染模型和细胞感染模型中,突变株的增殖明显减弱;突变株对酸性环境压力更敏感。以上结果提示,mkl基因在海分枝杆菌抵抗宿主免疫及致病中发挥重要作用。

利用MigR1质粒构建CD19-CAR逆转录病毒载体优化其对人原代T细胞的转染效率

目的优化二代CD19嵌合抗原受体（CD19-CAR）逆转录病毒载体对人原代T细胞的转染效率。方法应用重组DNA技术将CD19．CAR构建人逆转录病毒载体，转入plat-A包装细胞收集病毒上清并转染人原代T细胞及K562细胞系，采用流式细胞术检测不同条件下的转染效率，用RT-PCR方法检测目的基因的表达情况，用ELISA法检测IFN-γ、TNF-α表达水平。结果①MigR1-CD19-CAR逆转录病毒载体成功构建后包装高滴度逆转率病毒；②相同条件下，MigR1-CD19-CAR逆转录病毒对K562细胞系转染效率显著高于T细胞；③对T细胞，离心120min组的转染率为（54．5±14．6）％，明显高于未离心组、离心30min组及离心60min组（P值均〈0．05）；④CD3／CD28磁珠与rhIL-2联合对人T细胞活化扩增效率个体差异显著，根据扩增倍数优化个体转染时机可提高转染效率（最高达69．3％），且RT-PCR检测证实CD19．CAR目的基因在转染后72hT细胞中高效特异性转录；⑤CD19-CAR-T细胞与CD19．K562细胞共培养组IFN-γ、TNF-α表达水平均增加，分别为（13230±1543）pg／ml、（4217±211）pg／ml，与阴性对照组比较差异均有统计学意义（P值均〈0．01）。结论通过MigR1-CD19-CAR逆转录病毒载体转染人原代T细胞，并通过延长离心转染时间、根据扩增倍数确定个体转染时机而成功优化转染效率，RT-PCR检测CD19-CAR目的基因在转染后人T细胞中高效特异性转录，CD19-CAR-T细胞特异性识别靶细胞引发IFN-γ、TNF-α表达水平增加。