不同X线剂量照射对骨髓间充质干细胞的增殖及DNA损伤的影响

目的低剂量电离辐射对骨髓间充质干细胞(human mesenchymlstem cells-bone marrow,HMSC-bm)有兴奋效应,但高剂量电离辐射对该细胞的损伤作用少见报道。文中旨在研究不同X线剂量照射对体外骨髓间充质干细胞细胞增殖及DNA损伤影响。方法采用人HMSC-bm体外进行培养,实验分为对照组及照射组,以0、0.5、1、2、4、6、8 Gy不同X射线分别照射细胞,采用CCK8法检测细胞增殖水平;以0、1、2、4 Gy不同剂量照射细胞:CB法检测各组细胞微核率;免疫荧光检测照射后0.5、2、12、24 h不同时间点53BP1免疫荧光簇焦点(foci)数目的变化。结果随辐照剂量的增加,与0 Gy比较,除第3天0.5、1 Gy外,同一时间各组细胞吸光度值(A值)逐渐减少(P<0.05)。与同一辐照剂量第1天比较,0.5、1、4 Gy第3、4、5天A值增加(P<0.05),0、6 Gy第4、5天A值增加(P<0.05),2、8 Gy第5天A值增加(P<0.05)。细胞受照后0.5 h均出现foci点,达到最高峰,后随着时间的延长,foci点逐渐减少;不同剂量同一时间相比,随着剂量的增加,各个时间点免疫荧光簇集点增加,同一剂量不同时间相比,随着时间的增加免疫荧光焦点逐渐减少(P<0.05)。与对照组细胞微核率[(6.333±2.031)%]相比,随着辐射剂量增加(1、2、4 Gy)细胞微核率逐步上升[(23.667±1.582)%、(42.000±4.583)%、(777.333±2.082)%],差异有统计学意义(P<0.05)。结论 HMSC-bm对高剂量X射线具有敏感性,基因组不稳定,其自我修复能力受到剂量的影响,在运用放射疗法及临床治疗上应该加强其应用安全性。

循环血miR-21在空间辐射监测中的应用潜力

深空探测中如何在辐射暴露早期用快速、简便的方法进行辐射损伤及风险评估问题，对传统的辐射剂量计提出巨大的挑战。循环血microRNA(miRNA)具有很好的特异性和稳定性，且积极响应外界环境变化，因此，筛选循环血中辐射敏感的miRNA,对开发基于血液的微创生物辐射标志物具有较大的研究意义和应用价值。本文利用X射线对昆明小鼠进行全身照射，24小时后取血，利用miRNAPCRarray的方法检测了21种候选miRNA的表达谱水平，发现多种miRNA对辐射有响应，其中miR-21具有较大的变化幅度。利用实时定量PCR分别验证了miR-21在不同射线（X射线、碳离子束、铁离子束）条件下的剂量效应和时间效应。检测了miR-21在相同和不同鼠龄小鼠个体间的本底表达水平。结果表明，miR-21在不同类型射线照射下表达水平都有升高的趋势，特别是对低剂量辐射也具有显著的响应，具有较强的剂量效应关系。在6.72小时内，其表达水平维持在一个稳定的阈值内。miR-21在相同和不同鼠龄小鼠个体间的本底表达水平不具有差异性,在血清样本的保存及RNA的提取过程中具有较强的稳定性。以上特征说明miR-21具有作为生物辐射剂量计并应用于辐射损伤检测的潜力。

当归及当归多糖对X射线照射致SD大鼠免疫功能损伤的影响

目的探讨当归及当归多糖对X射线照射致SD大鼠免疫功能损伤的防护作用。方法将40只SD大鼠随机分为对照组、模型组、当归水煎液组、当归多糖组和阳性对照组。常规饲养14 d后,各给药组给予相应药物灌胃,对照组和模型组给予等体积蒸馏水灌胃,每日1次,连续7 d。第8日除对照组外其余各组大鼠进行全身X射线照射,连续2 d,每日1次,每次3 Gy,总吸收剂量为6 Gy。辐射后第3日股动脉采血处死大鼠,血常规检测外周血白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)、血小板(PLT),有核细胞计数法观察骨髓有核细胞数量,HE染色观察脾脏病理形态,ELISA检测血清干扰素-γ(IFN-γ)和白细胞介素(IL)-4的含量。结果与对照组比较,模型组大鼠脾脏指数、血WBC、骨髓有核细胞数、血清IL-4和IFN-γ含量明显降低(P<0.05),RBC和HGB明显升高(P<0.05);与模型组比较,各给药组血WBC、骨髓有核细胞数、血清IL-4和IFN-γ含量明显升高(P<0.05),RBC和HGB明显降低(P<0.05)。结论当归及当归多糖对X射线照射致SD大鼠免疫功能损伤具有保护作用。

蛇床子素对模拟微重力引起的骨质流失的防治作用

目的研究蛇床子素对模拟微重力导致大鼠骨质流失的防治作用。方法将Wistar大鼠随机分为3组:对照组(Ctrl)、尾吊组(HLS)、尾吊给药组(OST)。4周后取后肢骨用双能骨密度仪及万能试验机分别测量各组股骨骨密度及生物力学,并通过micro CT分析骨小梁参数;用Van Gieson(VG)染色观察胫骨形态变化。通过qRT-PCR检测胫骨骨保护素(OPG)和核因子-κB受体激活剂配体(RANKL)mRNA表达水平。用ELISA试剂盒检测血清中骨特异性碱性磷酸酶(BALP)、骨钙素(OCN)和抗酒石酸酸性磷酸酶-5b(TRACP-5b)的含量变化。结果与对照组相比,尾吊组大鼠股骨骨密度及生物力学参数显著降低(P<0.05),与尾吊组相比,尾吊给药组骨密度及生物力学显著上升(P<0.05);尾吊组骨小梁体积分数(BV/TV)、厚度(Tb.Th)显著降低(P<0.01),间距(Tb.Sp)显著升高(P<0.01),尾吊给药后BV/TV、Tb.Th及Tb.Sp显著降低(P<0.01);VG染色观察尾吊组胫骨骨小梁间隙变大,数量减少,而尾吊给药组骨小梁骨髓腔减少,数量增多;尾吊组血清BALP和OCN浓度显著降低(P<0.05),TRACP-5b浓度显著升高(P<0.05),当给予蛇床子素后,BALP浓度显著升高(P<0.05),而TRACP-5b浓度显著降低(P<0.05);尾吊组胫骨OPG/RANKL比值显著降低(P<0.05),尾吊给药后,OPG/RANKL比值显著升高(P<0.05)。结论蛇床子素可通过促进骨形成和抑制骨吸收两方面有效防治模拟微重力导致的骨质流失。

当归多糖防护X线对大鼠骨髓及脾脏损伤的研究

目的探讨当归多糖对X线辐射所致SD大鼠骨髓及脾脏损伤的防护作用。方法将40只♂SD大鼠随机分为空白组、模型组、当归多糖低剂量组(63.5 mg·kg^(-1))、中剂量组(127 mg·kg^(-1))、高剂量组(254 mg·kg^(-1))。药物组每日以不同浓度的当归多糖2 m L灌胃1次,空白组及模型组用等量的蒸馏水代替,连续给药7 d后,分别对除空白组以外的各组大鼠进行全身X线照射,连续照射2 d,辐射总吸收剂量为6 Gy,末次辐射后d 3,麻醉后采血处死大鼠。检测各组大鼠一般生存质量、骨髓有核细胞数量、血常规,检测各组大鼠脾脏指数,显微镜观察脾脏病理变化,检测血清中γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ)和白介素-4(interleukin-4,IL-4)的含量。结果与空白组比较,模型组大鼠生存质量、骨髓有核细胞数量、白细胞数、脾脏指数、IFN-γ及IL-4表达量明显降低,而红细胞数、血红蛋白含量明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。HE染色可见脾小体萎缩明显,生发中心、白髓和红髓结构紊乱,淋巴细胞数量明显减少。与模型组比较,当归多糖给药组大鼠生存质量、骨髓有核细胞数量、白细胞数、脾脏指数、IFN-γ及IL-4表达量明显升高,而红细胞数、血红蛋白含量降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。HE染色可见脾脏病理损伤有所减轻,脾小体依稀可见,生发中心、红髓和白髓分界尚可见,淋巴细胞数量升高。结论当归多糖对辐射所致SD大鼠骨髓及脾脏损伤具有防护作用,其机制可能是通过减轻辐射对骨髓及脾脏造血细胞、免疫细胞的损伤,并补充机体血液及津液来实现的。

电离辐射促进神经胶质瘤细胞初级纤毛发生

研究电离辐射对人类神经胶质瘤细胞初级纤毛发生及初级纤毛对细胞辐射敏感性的影响。对两种神经胶质瘤细胞系(M059K和M059J)进行不同剂量的X射线或碳离子束照射,通过免疫荧光法检测电离辐射后细胞初级纤毛的发生率和长度的变化,通过细胞克隆存活实验检测siRNA(siIFT88)干扰IFT88基因抑制初级纤毛发生对细胞辐射敏感性的影响。结果表明:M059K和M059J细胞均具有初级纤毛,M059K细胞的初级纤毛发生率为(41.36±4.75)%,显著高于M059J细胞(8.07±1.58)%,两种细胞的纤毛平均长度均超过3μm,但M059J细胞对X射线和碳离子束的辐射敏感性更高;电离辐射能显著提高M059K细胞的初级纤毛发生率,10 Gy X射线照射时纤毛发生率接近60%,且X射线促进初级纤毛发生具有剂量和时间效应。通过转染siIFT88抑制初级纤毛能显著提高M059K细胞的辐射敏感性。因此,电离辐射能够促进人类神经胶质瘤细胞初级纤毛的发生,抑制初级纤毛发生能增强细胞的电离辐射敏感性。

槲皮素促进电离辐射引起的衰老细胞发生凋亡

研究槲皮素对10 Gy的X射线及碳离子束辐照后衰老的人眼基底脉络膜黑色素瘤细胞系92-1凋亡发生及相关蛋白表达水平的影响。采用流式细胞术及衰老相关半乳糖苷酶检测试剂盒检测92-1细胞经10 Gy的X射线及碳离子束辐照后细胞凋亡及衰老情况。通过Cell counting kit-8(CCK8)法检测槲皮素对92-1细胞增殖活力的影响并结合细胞凋亡检测筛选槲皮素作用浓度。采用Annexin V-FITC/PI双染法检测不同处理后92-1细胞的凋亡比例。采用蛋白免疫印迹法检测细胞凋亡相关蛋白Cleaved caspase-3的表达水平。结果表明,92-1细胞经10 Gy的X射线或碳离子束辐照后3 d,细胞出现明显的衰老表型,凋亡发生率较低。CCK8法结合细胞凋亡筛选出50μmol/L作为后续处理浓度。辐照后立即或3 d后给予槲皮素处理能诱导细胞发生明显的凋亡,且Cleaved caspase-3表达水平显著上调。因此,槲皮素可促使辐照(10 Gy)后衰老的92-1细胞发生凋亡。

未照射条件培养基通过影响活性氧水平引起细胞DNA损伤

转移条件培养基是开展细胞间信号传递研究的常用实验手段。在开展辐射诱导旁效应的研究过程中,我们发现未照射的条件培养基也能够引起细胞DNA损伤,为探索DNA损伤的来源,进行了一系列实验。通过测定细胞活力水平、DNA损伤水平、细胞活性氧水平的变化,发现细胞在接受条件培养基之后,细胞活性氧水平上升,细胞活力下降,细胞内的DNA损伤水平上升。这些结果表明,相对于完全未处理的细胞,源于未进行辐照处理细胞的条件培养基能够影响细胞内的活性氧水平,进而引起受体细胞的DNA损伤。因此,在采用条件培养基转移方法的研究,尤其是涉及活性氧及DNA损伤的研究之中,必须要考虑作为对照的条件培养基对细胞的影响。

电离辐射及不同条件培养基诱发骨髓间充质干细胞基因组不稳定性的比较研究

为了探讨不同剂量电离辐射及其所致条件培养基对肺癌相关骨髓间充质干细胞(bone marrowmesenchymal stemcells,BMMSCs)基因组不稳定性的影响,以A549和人BMMSCs为研究对象,采用X射线辐射和条件培养基转移的方法建立辐射旁效应模型,检测基因组不稳定性相关的细胞克隆存活率、微核率、53BP1(tumor suppressor p53 binding protein 1)焦点数等指标,同时采用ELISA法检测旁效应条件培养液不同时间点ROS、NO、TGF-β1的水平。结果显示:与正常BMMSCs组相比,IR组、A549-medium组和BMMSCs-medium组的细胞增殖均减少(P<0.05);细胞微核率和53BP1焦点数均增多(P<0.05);IR组变化最明显,其次为A549-medium组。此外,A549-medium组中TGF-β1、ROS以及NO的水平与BMMSCs-medium组相比均显著升高(P<0.05)。实验结果初步表明,辐射可能通过条件培养基中ROS、TGF-β1、NO等分子诱导未照射BMMSCs产生类似于直接辐射造成的基因不稳定性旁损伤效应,并且A549-medium组的旁损伤强于BMMSCs-medium组。

MicroRNA-19b通过下调BTG1增加重离子辐射诱导的基因组不稳定性

重离子束放疗可有效杀死肿瘤细胞。研究表明:重离子束能引起癌细胞的基因异常,引发基因组不稳定性。BTG1作为一个重要的G0/G1期相关蛋白,具有强烈的抗细胞增殖能力。以碳离子辐射为手段,通过蛋白质印迹杂交技术发现:人肾癌786-O细胞中BTG1能够对重离子辐射应激产生应答。同时,荧光定量PCR结果显示碳离子辐照后,BTG1转录本与micro RNA-19b的表达水平呈负相关变化。瞬时转染micro RNA-19b类似物于人肾癌786-O细胞中,能够抑制由碳离子辐射引起的BTG1蛋白上调,并增加细胞的微核发生率。因此micro RNA-19b能够通过抑制BTG1的表达,增加重离子辐射诱导的细胞基因组不稳定性。

黄芪多糖对X线辐射所致骨髓间充质干细胞细胞核、染色体及DNA损伤的影响

[目的]探索黄芪多糖（astragalus polysaccharide,APS）对X线辐射所致骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cell,BMSC）细胞核、染色体及DNA损伤的影响。[方法 ]采用CCK-8法检测不同浓度的APS对2Gy X线辐射后BMSC增殖能力的影响,以筛选出APS的最佳作用浓度。将BMSC分为空白（CTRL）组、黄芪多糖（APS）组、辐射（IR）组、辐射＋黄芪多糖（IR＋APS）组;APS组、IR＋APS组在第1次辐射前48h以最佳作用浓度的APS干预1次,以后每次辐射后均换上含APS的新鲜培养液,CTRL组、IR组则换上不含APS的新鲜培养液,共进行5次X线辐射,每次2Gy,每48h辐射1次;末次辐射后,采用胞质分裂阻断法检测各组细胞微核率,染色体核型分析各组细胞染色体畸变率,激光共聚焦显微镜检测各组细胞53BP1 foci焦点簇数目。[结果]与CTRL组比较,辐射后BMSC增殖能力明显受到抑制,差异具有统计学意义（P〈0.05）;与IR组比较,当APS为50μg/ml时对辐射后BMSC增殖的作用最强,故选为最佳作用浓度。在细胞核水平上,与CTRL组比较,IR组微核率显著升高（P〈0.05）;与IR组比较,IR＋APS组微核率降低（P〈0.05）。在染色体水平上,与CTRL组比较,IR组染色体畸变率明显升高（P〈0.05）;与IR组比较,IR＋APS组染色体畸变率降低（P〈0.05）。在DNA水平上,与CTRL组比较,IR组53BP1 foci焦点簇数目显著升高（P〈0.05）;与IR组比较,IR＋APS组53BP1 foci焦点簇数目降低（P〈0.05）。[结论 ]黄芪多糖具有减轻X线辐射后BMSC细胞核、染色体、DNA损伤的作用。

黄芪多糖对重离子辐射BMSCs防护作用及与NF-κB相关机制研究

目的:研究黄芪多糖(APS)对重离子辐照人骨髓间充质干细胞(BMSCs)促增殖作用、维持其基因组不稳定性以及与NF-κB信号通路相关机制。方法:体外培养人BMSCs,随机分为Ctrl组、APS组、IR组、APS+IR组。Ctrl组为常规BMSCs,APS组用50μg/mL APS干预BMSCs,IR组用2Gy 12C6+辐照BMSCs,APS+IR组用50μg/mL APS干预受辐照BMSCs。CCK-8法和克隆形成实验测各组细胞增殖能力;细胞松弛素法测各组BMSCs的微核率;免疫荧光测53BP1免疫荧光簇集焦点;WesternBlot检测P65、p-P65、COX-2蛋白表达。结果:与Ctrl组比较,12C6+辐射后BMSCs增殖水平降低,克隆形成数减少(P<0.05);微核率和免疫荧光焦点显著增多(P<0.01);P65、p-P65、COX-2等相关蛋白上调(P<0.05,P<0.01)。与IR组比较,APS+IR组BMSCs细胞增殖水平升高,克隆形成数增多(P<0.05);微核率和免疫荧光焦点显著减少(P<0.01,P<0.05);P65、p-P65、COX-2蛋白下调(P<0.05)。结论:APS对2Gy 12C6+辐射BMSCs具有促增长作用,可能和下调NF-κB信号通路相关蛋白,维持BMSCs基因组稳定性有关。

黄芪皂苷对X线诱发骨髓间充质干细胞的基因损伤的保护作用

目的研究黄芪皂苷(AS)对X线辐照骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖水平影响及其诱发DNA损伤的保护作用。方法将细胞分为4组:空白组、AS组(50μg·mL^(-1)AS)、辐射组、辐射+AS组(50μg·mL^(-1)AS)。药物干预3 d后,辐射组、辐射+AS组用2 Gy X线进行照射。用CCK-8法检测各组细胞的增殖能力(OD值),微核法检测各组BMSCs的微核率,免疫荧光法检测53BP1焦点数。结果空白组、AS组、辐射组和辐射+AS组在5 d的增殖能力分别为1.26±0.06,1.16±0.03,0.88±0.02和0.96±0.03;这4组在0.5 h的53BP1焦点簇的数目分别为10.00±2.00,9.66±3.06,875.33±41.06和704.66±47.42;这4组的微核率分别为(0.40±0.17)%,(0.50±0.20)%,(5.93±0.97)%和(3.97±0.61)%。上述指标,辐射组与空白组相比,或辐射+AS组与辐射组相比,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论AS对X线辐射诱发人骨髓间充质干细胞的增殖及基因组DNA损伤有防护作用。

BTG1蛋白及其上下游信号通路对X射线和碳离子辐射的应激响应

BTG1是重要的抗细胞增殖蛋白,在细胞对外界胁迫如电离辐射等的应激响应过程中发挥重要功能。到目前为止,电离辐射诱导BTG1蛋白表达水平的长期变化情况、其对细胞基因组稳定性的影响及上下游相关的信号通路仍未完全阐明。通过荧光定量PCR技术发现BTG1对X射线和碳离子的应激呈现出先迅速升高再缓慢下降的过程。此外,微核实验表明,通过转染基因的质粒过表达载体或si RNA的方法外源性增加或抑制786-O细胞内BTG1的表达水平均能够显著影响碳离子辐照诱导的基因组不稳定性。深入研究发现电离辐射诱导的NF-κB的表达和活化可能通过引起SKA2基因的表达而间接地调控BTG1的表达,而BTG1则可能激活PRMT1的活性而引起基因组表观遗传学的改变,进而影响细胞的基因组稳定性、细胞周期调控以及凋亡等进程。