表达猪瘟病毒E2和猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白重组腺病毒动物免疫保护试验

为研究共表达猪瘟病毒(CSFV)E2基因和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5基因的重组腺病毒(rAd-E2-GP5)的免疫保护效果,将rAd-E2-GP5免疫34日龄~38日龄的健康断奶仔猪2次(间隔20d),同时设商品苗和空白对照组,二免21d后攻毒。ELISA结果显示,rAd-E2-GP5免疫后可检测到抗CSFV特异性血清抗体,未检测到抗PRRSV特异性血清抗体。组织核酸RT-PCR检测、临床症状和病理变化观察结果显示,重组腺病毒组分别攻击CSFV、PRRSV、CSFV+PRRSV强毒,死亡率为0,分别有0/5、4/5、4/5头表现临床症状,2/5、5/5、5/5头有眼观病变,0/5、4/5、4/5头检出PRRSV;商品苗组分别攻击CSFV、PRRSV、CSFV+PRRSV强毒,死亡率为0,分别有0/5、1/5、1/5头表现临床症状,3/5、4/5、3/5头有眼观病变,0/5、1/5、1/5头检出PRRSV;重组腺病毒组和商品苗对照组组织中均未检测到CSFV;空白对照组5/5头表现典型临床症状,5/5头死亡,5/5头检出PRRSV或CSFV。说明构建的rAd-E2-GP5能保护致死量的CSFV、PRRSV和CSFV+PRRSV强毒的攻击,但大部分猪有临床症状和病理变化。后续的研究中仍需要进一步加强重组疫苗对PRRS保护效果的试验,为CSF和PRRS联合疫苗的研发和实际应用奠定基础。

猪瘟病毒石门株NS3蛋白的原核表达及其抗体检测间接ELISA的建立

为配合猪瘟新型疫苗的研发,建立了猪瘟病毒NS3蛋白抗体检测间接ELISA,以期达到有效区分新型疫苗免疫猪与自然感染猪(包括常规疫苗接种猪)的目的。以接种猪瘟病毒(CSFV)石门株的PK-15细胞为模板提取总RNA,经特异性PCR扩增获得长度为2 049bp的CSFV NS3基因,将其克隆至插入了具有自聚集自切割功能短肽的原核表达载体pET-32a(+),在大肠埃希菌Rosetta(DE3)中优化表达CSFV石门株NS3基因。Western blot分析表明重组蛋白NS3具有反应原性。将纯化的重组蛋白NS3作为包被抗原建立检测CSFV NS3抗体的间接ELISA,以美国爱德士(Idexx)猪瘟病毒抗体检测试剂盒抗体检测结果为标准,对502份血清样品进行检测。结果表明,所建立方法的特异性为96.9%,敏感性为89.7%,总符合率为95.8%,为猪瘟新型疫苗的推广应用提供了血清学检测方法。

猪ASC及Ub基因的克隆及真核表达重组质粒的构建

炎症小体不仅参与机体的天然免疫反应,同时还参与机体抗病毒等多种宿主防御反应。在多种疾病相关信号通路反应中都伴随着蛋白质的泛素化修饰。NOD样受体(NLRs)介导的炎症小体信号通路中,凋亡相关点状样蛋白(ASC)是关键的接头蛋白。为了解猪瘟病毒(CSFV)感染对ASC泛素化水平的影响,通过RT-PCR从猪血管内皮细胞(ECs)中扩增获得ASC和泛素(Ub)的全长cDNA双链片段,连接至克隆载体pMD-18T,获得重组克隆质粒pMD-ASC和pMD-Ub。双酶切pMD-ASC获得ASC目的序列,连接至pcDNA3.1-Flag,双酶切pMD-Ub获得Ub目的序列,连接至pcDNA3.0-HA,获得重组表达质粒pcDNA3.1-Flag-ASC和pcDNA3.0-HA-Ub。将pcDNA3.1-Flag-ASC和pcDNA3.0-HA-Ub转染ECs,Western blot在蛋白水平检测ASC和Ub的表达。结果表明,成功构建了带有Flag标签的ASC真核表达质粒和带有HA标签的Ub真核表达质粒,且在ECs中获得高效表达,为进一步体外研究CSFV调控猪血管内皮细胞ASC泛素化的机制提供了实验基础。