橡胶树体胚苗质量调查与分析

天然橡胶是我国重要的战略物资和工业原料,主要来源于橡胶树。橡胶树生长周期长,其苗木质量直接影响天然橡胶产业的发展,橡胶树体胚苗在前期研究中表现一致性好,且具有速生、高产的优势。海南省天然橡胶新型种植材料创新基地是当前规模生产的橡胶树体胚苗的基地,现生产品种有热研73397和热研917。本研究分析比较了热研73397体胚试管苗在2018—2020年间的株高、茎粗、叶片数、主根长等指标的差异性,比较了2020年2个品种各指标的差异性,并对不同年份不同品种进行分级比较,以期阐明橡胶树体胚苗规模生产的情况。结果表明:(1)2018—2020年,热研73397的株高、茎粗、叶片数、主根长度在各区间的比例相当;株高、叶片数、主根长度在3 a间的差异不显著;茎粗在2018和2019年之间差异显著,且3 a均值均在2.00 mm以上,最大值和最小值的差值仅为0.09 mm。(2)2020年,热研73397和热研917体胚苗的株高一致,均值均为8.0 cm,且大部分集中在5.0~10.0 cm,分别占66.13%、66.91%;热研73397和热研917的茎粗范围分别为0.80~4.23 mm、1.13~3.73 mm,均值分别为2.11 mm和2.18 mm,2个品种的茎粗在1.50~3.00 mm之间高度集中,分别占85.94%、83.82%;热研73397和热研917叶片数范围分别为0~6片和1~4片,2个品种叶片数绝大多数为1~3片,分别占88.82%、96.32%,其中热研917叶片数为2片的占比高达52.94%;热研73397的主根长度均值为9.5 cm,而热研917的为9.1 cm,2个品种的主根长度多数集中在8.0~12.0 cm之间,分别占74.12%、79.41%;方差分析结果表明,2020年2个品种的株高、茎粗、叶片数差异不显著,主根长度差异显著(P<0.05)。(3)2018—2020年调查的橡胶树体胚苗中,不同年份不同品种的橡胶树体胚苗,一级苗比例为19%~22%,二级苗比例为56%~62%。据此,规模化生产橡胶树体胚试管苗质量稳定,为橡胶树体胚苗生产工艺的推广应用提供参考。

橡胶树EST-SSRs发掘研究

随着橡胶树大量ESTs序列的产生,为EST-SSRs发掘提供了丰富的公共序列资源。本研究首先将11809条橡胶树ESTs组装成3932条非冗余序列,其中323条ESTs检索到SSRs358个,SSRs出现的频率为9.1%。SSR重复单元共93种,其中二核苷酸重复(57.5%)、三核苷酸重复(26.0%)和六核苷酸重复(12.8%)占所有重复单元的96.3%。对323条SSR-ESTs进行特异扩增引物设计,共获得158对引物,对48份包括31份魏可汉种质、12份1981'野生种质、2份色宝橡胶、2份光亮橡胶和1份少花橡胶扩增,其中60对引物扩增出1条预期长度DNA片段,占所有设计引物的38%,并筛选到40对具有多态性的引物。EST-SSRs标记的发掘为巴西橡胶树分子辅助育种、种质资源功能遗传多样性分析等研究提供了良好的标记。

橡胶树次生体胚发生及其再生植株遗传稳定性的分子检测

以热研7-33-97花药为材料,建立橡胶树次生体胚发生和植株再生体系,主要包括初生花药体胚诱导、次生体胚发生和次生胚植株再生三个步骤。结果表明,来自花药初生异常胚和初生子叶期胚的0.2～0.3cm胚块均能成功诱导次生体胚发生,并均能获得成熟子叶期胚。以初生异常胚为外植体,每个胚块获得子叶期胚数为0.64个。以初生子叶期胚为外植体连续3次诱导次生体胚发生,随诱导次数增加,体胚发生频率先上升,后保持稳定。2,4-D对次生体胚植株再生具有明显影响,添加4.5μmol/L和9μmol/L2,4-D植株再生培养基中植株再生频率达到85.0%。AFLP检测次生体胚植株遗传稳定结果显示:(1)来自初生异常胚的次生体胚植株60.0%植株DNA发生变异;(2)来自初生子叶期胚的次生体胚植株,随次生体胚发生次数增加,检测到DNA变异植株频率由30.0%升高到52.4%。AFLP聚类分析结果显示,次生体胚植株与热研7-33-97高度相似,相似系数大于0.904。

橡胶树HbFCA启动子的克隆及其在橡胶树中的表达分析

FCA(Flowering control locus A)基因是自主开花调控途径中的关键调控基因之一,同时,FCA功能具有多样性。本研究中,利用TAIL-PCR方法获得2 039 bp橡胶树FCA基因的启动子序列,生物信息学分析发现该启动子中具有28种顺式调控元件,其中主要为基因表达调控核心元件(TAAT-box和CAAT-box)和光响应调控元件。此外,还含有激素、胁迫信号和光周期的顺式作用元件。同时,将橡胶树FCA启动子与GUS基因融合构建植物表达载体转化橡胶树,发现在胚状体、叶片和树根中GUS基因均强烈表达,但在茎段中表达较弱,说明橡胶树FCA基因除参与开花调控外,还可能参与多种发育过程的调控。本研究获得的HbFCA启动子转化橡胶树植株为进一步分析HbFCA基因功能及表达调控模式提供了遗传材料。

甘蓝型油菜三体、双三体和双四体的形态和细胞学特征

从甘蓝型油菜品种“Oro”×诸葛菜杂交后的一个混倍体杂种（2n=19～37）的小孢子再生植株中鉴定出1株2n=42的植株，此混倍体不含有诸葛菜染色体，故2n=42植株的细胞内没有诸葛菜染色体。用其花粉授予“Oro”后获得2n：39、40的植株。2n=39、40、42植株PMCs内染色体的主要配对方式分别为19Ⅱ＋1Ⅰ、19Ⅱ＋2Ⅰ和19Ⅱ＋2Ⅱ，后期Ⅰ的分离方式分别为20：19、21：19和21：21。故2n=39、40、42为甘蓝型油菜的三体、双三体、双四体。最后讨论了这些种内非整倍体材料在油菜遗传研究中的意义。

启动子陷阱技术在橡胶树中的应用研究

启动子陷阱技术是克隆未知基因启动子的有效途径。首先用反向无启动子的GUSA替换pCAMBIA-2301载体上的GUSA及启动子序列,构建橡胶树启动子陷阱载体pCAMBIA2301:GUS-NOS,然后转化橡胶树。结果表明:获得了GUS染色阳性胚状体6个,再生后获得2个转基因株系。其中1个株系在胚状体、叶片和根中能检测到GUS基因的强烈表达,另1个株系仅在根中检测到微弱的GUS基因表达,说明获得的转基因植株为不同启动子启动GUS基因的株系。因此通过橡胶树启动子陷阱载体的构建及其在橡胶树中的表达,能够发现和克隆橡胶树内源基因的启动子。

橡胶树体胚再生试管改进及其对植株再生和移栽的影响

培养环境是影响植株生长的重要因素。本研究首先对常规培养试管进行改进,将原试管塑料盖改为透气性塑料盖,由带透气槽的盖子、密封垫圈、透气孔和空气过滤膜组成。然后,研究改造后的试管对环境污染控制及橡胶树植株再生和移栽的影响,结果发现由环境所造成的污染大幅下降,污染率低于5%。同时,由于试管内外空气的流通,提高了体胚植株再生频率,最高提高了15.9%。另外,植株移栽成活率也得到提高,最高提高达5.9%。因此,本研究设计的试管通过增加透气性,显著提高了植株再生率和移栽成活率,降低环境污染率。

甘蓝型油菜亚倍体(2n=30)后代的染色体及基因组组成分析

甘蓝型油菜亚倍体（2n=30）与白菜杂交后代的染色体数目为2n=22、24—28、31，自交后代的染色体数目为2n=30—36。对此亚倍体自交后代进行扩增片段长度多态性（AFLP）指纹分析并按照类平均法（UPGMA）进行聚类分析，它们被明显分为甘蓝型油菜类（I）和白菜及白菜型油菜类（Ⅱ）两类。I类植株基因组组成与甘蓝型油菜相似，Ⅱ类植株则与白菜及白菜型油菜相似。在花粉的可染性、单角结实率和单株结角率等性状上，Ⅱ类植株较I类植株表现更好。据此推测白菜型后代是由A基因组染色体和与A基因组同源性较高的部分C基因组染色体的配子结合而产生。

甲基氨草磷对橡胶树悬浮细胞同步化及微核诱导的影响

植物微原生质体融合(microprotoplast fusion)是将部分基因组转移而又避免染色体损伤的不对称融合技术,微原生质体成功诱导是微原生质体融合的先决条件。本研究在摸索甲基氨草磷(amiprophos-methyl,APM)对橡胶树悬浮细胞有丝分裂中期指数和染色体形态影响基础上,研究了酶解时间及酶解过程中添加APM对微原生质体产量的影响。结果发现,悬浮细胞随APM处理浓度和时间的增加,有丝分裂中期指数先升高再下降,处理12 h时达到最大值;染色体聚集程度也先增加再降低,处理16 h时染色体开始解聚。在酶解过程中添加APM和延长酶解时间会大大降低微原生质体的产量。悬浮细胞经过1μmol/L APM处理10 h后,酶解10 h,中期细胞可达到79.4%,微核化细胞指数达到7.3%,从而建立了APM诱导橡胶树悬浮细胞同步化及高效获得橡胶树微化细胞的方法。

根癌农杆菌介导的橡胶树花药愈伤组织遗传转化体系的建立

为建立根癌农杆菌介导的橡胶树遗传转化体系,以花药愈伤组织为受体,研究了农杆菌菌株、共培养温度、共培养时间、乙酰丁香酮(AS)等因素对遗传转化效率的影响。结果表明,农杆菌菌株、共培养温度和共培养时间对转化效率具有显著影响,AS不影响转化效率。2.2万个花药愈伤组织经EHA105菌株侵染后,转入未添加AS的培养基,22℃共培养6d,通过50mgL-1卡那霉素抗性筛选、叶片GUS染色、uidA和NptII基因PCR特异扩增、PCR产物测序及NptII基因Southern检测,鉴定出11株转基因植株,并通过嫁接和次生体胚发生,获得来自8个转基因株系的681株转基因植株,移栽成活253株。

植物远缘杂交中的染色体行为及其遗传与进化意义

远缘杂交与多倍体化在高等植物的进化中起着重要的作用。但矛盾和令人费解的现象是“自然界在合成多倍体方面取得了巨大的成功,而人类在这方面却收效甚微”。其原因一方面可能是自然多倍体是长期自然选择和进化的产物,人类难以在短期内重复和完成这一过程;另一方面可能对不同的染色体组结合后的遗传与互作机制还不太了解。故多倍体化后的遗传和表观遗传成了目前多学科研究的重点。在有些有性和体细胞杂种内亲本染色体在细胞内分开排列,但此染色体行为的遗传和生物学意义还不太清楚。在植物远缘杂交中出现的假配生殖、半配生殖、染色体消除和亲本染色体组分开等异常染色体行为,也反映出不同物种在配子和染色体水平上的不亲和。需对植物远缘杂交中的染色体行为和遗传进行不同层次与系统的研究,才可能深入了解杂交后新种的形成及进化机制。

植物原生质体融合研究进展及其在育种中的应用

植物原生质体融合即体细胞杂交是有性杂交的重要有益补充。本文主要介绍植物原生质体融合技术(包括融合方法和融合方式)的研究进展及其在植物育种中的主要应用,并分析和探讨体细胞杂交育种在实践中存在的一些问题,同时对其应用前景作出展望。

橡胶树热研8-79原生质体培养再生植株

【目的】优化橡胶树热研8-79原生质体分离和培养条件,建立橡胶树原生质体培养植株高效再生体系,为橡胶树体细胞杂交育种奠定基础。【方法】以橡胶树热研8-79花药愈伤组织建立的胚性细胞悬浮系为试验材料,设计不同酶组合、酶解时间和悬浮细胞继代时间进行原生质体分离,采用不同培养基、看护细胞浓度和接种密度进行原生质体培养,对原生质体分裂发育的小愈伤组织进行体细胞胚诱导及植株再生培养,统计原生质体的产量、分裂频率、体胚数及体胚萌发率。【结果】酶组合为纤维素酶1.50%+果胶酶0.15%+离析酶0.50%、酶解时间为12 h时,继代培养第5 d的胚性悬浮细胞达最高产量(3.6×107个/mL PCV);用酶解细胞和看护细胞继代培养基分别作为原生质体液体培养基和看护培养基,比使用KPR培养基更有利于原生质体的分裂,当看护细胞浓度为5%、接种密度为5×105个/mL时原生质体的分裂频率最高,达54%。原生质体持续分裂形成肉眼可见的小愈伤组织增殖后经体胚发生途径发育成完整的小植株。【结论】通过优化橡胶树热研8-79胚性悬浮细胞原生质体分离的酶组合、酶解时间、继代培养时间及看护培养过程中培养基组成、看护细胞浓度和接种密度等影响因素,可以建立橡胶树原生质体培养植株高效再生体系。

抗、感橡胶树种质对六点始叶螨发育与繁殖的影响

在温度(28±1)℃、RH(75±5)%、光照周期14(L)∶10(D)的条件下,研究了经抗、感性初步筛选获得的5份抗性和5份敏感橡胶树种质对六点始叶螨发育与繁殖的影响。结果表明:抗、感橡胶树种质对六点始叶螨的发育历期、产卵量、后代卵孵化率、性比和成螨寿命均存在显著影响;抗性橡胶树种质对六点始叶螨的发育与繁殖具有显著的抑制作用。取食抗性橡胶树种质IRCI12后,六点始叶螨不能完成发育与繁殖,取食后成螨存活率仅为6.80%,且最多可存活7.40 d;平均每雌产卵量为4.90粒,且不能孵化。与取食敏感种质RRII103、RRII105、IAN2887、IAN2904和桂研77-11-23(多)相比,取食抗性种质热研87-6-5、IAN717、RRIM600和RRIC52后,六点始叶螨各龄螨的发育历期均显著延长,产卵量显著减少,后代孵化率和雌性百分率显著降低,成螨寿命显著缩短。该结果为深入开展橡胶树抗螨性机理和橡胶树抗螨种质的挖掘及其利用研究以及充分发挥抗性种质在橡胶树害螨防控中的主导作用提供理论基础。

抗生素对巴西橡胶树花药愈伤组织生长与分化的影响

将巴西橡胶树花药胚性愈伤组织接种到添加不同浓度的羧苄青霉素、头孢霉素和特泯丁3种抑制农杆菌生长的抗生素培养基上,结果表明:除500mg/L特泯丁抑制胚性愈伤组织生长但促进体胚发生,其它抗生素均为促进愈伤组织生长但抑制体胚发生。潮霉素、卡那霉素和巴龙霉素3种筛选抗生素均抑制愈伤组织生长和体胚发生,三者抑制能力顺序为潮霉素>卡那霉素>巴龙霉素,但潮霉素完全抑制了体胚发生,而巴龙霉素则与对照相似即对体胚发生几乎没有抑制作用。故特泯丁可以作为农杆菌介导巴西橡胶树花药愈伤组织遗传转化的抑菌抗生素,500 mg/L使用浓度效果较好,卡那霉素作为筛选抗生素,50 mg/L使用浓度效果较好。

橡胶树种质资源大田种质库寒害调查报告

为了全面了解橡胶树野生种质资源对低温胁迫的忍受能力,在2007—2008年发生典型平流型寒害后即采用苗期寒害鉴定和分级方法对1675份1981’IRRDB野生种质资源和215份Wickham栽培种质进行逐株调查。调查结果表明:Wichham栽培种质有19.07%的平均寒害级别小于1级,而野生种质中有55%显示出对低温具有一定的忍耐能力,说明种质群体中存在大量的耐寒基因,且以来自Rodonia地区的抗寒基因材料选出率较高,可作为抗寒种质选择的优质、高效群体。

萝卜与甘蓝属间杂种基因组原位杂交分析

用基因组原位杂交方法（Genomic in situ hybridization，GISH）研究了萝卜（Raphenus setivus，2n=18，RR）和甘蓝（Brassica oleracea，2n=18，CO）属间杂种F1减数分裂过程。结果表明杂种体细胞染色体组成为RC，2n=18，但花粉母细胞有3种类型：（1）RC，2n=18，终变期染色体平均配对构型为14．87 Ⅰ＋1．20Ⅱ＋0．04Ⅲ＋0．06Ⅳ，染色体配对主要发生在萝卜和甘蓝染色体之间；后期Ⅰ 9条萝卜染色体主要以5／4和6／3的分离比移向两极，所形成配子的染色体数目和组成均不平衡，配子败育。（2）RRCC，2n=36，终变期染色体形成18个二价体；后期Ⅰ染色体均衡分离，形成RC不减数配子。（3）RRCC亚倍体，2n=30～34，少数萝卜染色体丢失，形成的配子具有全套的甘蓝染色体和部分萝卜染色体。

不同因素对橡胶树内珠被愈伤组织诱导和体细胞胚发生的影响

为了优化橡胶树内珠被植株再生体系,促进其次生体胚技术和转基因研究的发展,以橡胶树品种‘热研7-33-97’和‘热研88-13’的幼果内珠被为材料,进行不同因素对橡胶树内珠被愈伤组织诱导和体细胞胚发生的研究。在添加不同浓度的2,4-D,外加80g/L蔗糖、50mg/L椰子水、5.0mg/L AgNO3和2.3g/L phytagel的MH培养基上诱导愈伤组织的产生。结果表明,当培养基中不添加2,4-D时,2个品种均不能诱导出愈伤组织,随着2,4-D浓度的增加,其愈伤诱导率不断增加,达到4.0mg/L水平时,诱导率均达到最大,分别为88.28%、86.67%。当浓度逐步升高至6.0mg/L时,其诱导率又有所下降。愈伤诱导后,将其转移到添加了不同浓度NAA的改良MS基本培养基上。结果发现,0.2mg/L的NAA浓度更有利于橡胶树‘热研7-33-97’内珠被子叶胚、喇叭胚、杯状胚和多叶胚等胚的产生,但子叶胚出胚率也仅达4.00%,而低于或高于此浓度均不利于体细胞胚的产生。

利用EST-SSRs标记分析巴西橡胶树魏克汉种质的遗传多样性及遗传分化

橡胶树魏克汉（Wickham）种质是指1976年英国人魏克汉在亚马逊河下游与塔帕若斯（Tapajos）河汇合处的博因（Boim）采集并培育46株母树繁殖的后代中选出的初生代及其后杂交的次生代至多生代栽培品种。本研究利用25对EST-SSRs引物,对中国热带农业科学院橡胶研究所国家橡胶树种质资源圃中保存的来自6个国家的278份魏克汉种质进行遗传多样性和遗传分化分析。种质总群体共检测出等位变异103个,平均等位基因数（Na）4.12个,稀有等位基因占全部等位基因的14.56%;平均期望杂合度（He）值和Nei平均多样性指数（H）值分别为0.4108和0.4100;聚类分析得到种质个体间的遗传距离（GD）为0~1.1632。不同国家种质群体间的遗传多样性指数（H）值：巴西〉斯里兰卡〉印度尼西亚〉中国〉马来西亚〉泰国,但经SPSS非参数检验表明6个国家群体之间的种质遗传多样性水平差异并不显著;不同国家种质群体间的遗传一致度（GI）为0.9812~0.9869,与中国种质的亲缘关系最近的是印度尼西亚、其次马来西亚、泰国、斯里兰卡、巴西;仅3%的遗传变异来源于不同国家种质群体间,不同国家种质间的平均基因流（Nm）为4.463,大而通畅的基因流是橡胶树6个国家群体间遗传分化水平很低的主要原因。研究结果表明,中国国家橡胶树种质资源圃保存的魏克汉种质的遗传多样性较差,但通过EST-SSRs可检测到丰富的稀有等位基因。虽然不同国家种质交流频繁,导致种质之间和不同国家来源种质之间遗传距离非常近,但是,种质之间和不同国家来源种质之间依然存在一定的遗传分化,特别是巴西种质与中国种质遗传距离最远,基因流最小,遗传多样性最为丰富。

橡胶树转基因植株遗传稳定性分析

以GUS染色为阳性的抗性胚状体继代再生植株的叶片为材料,通过PCR分析结合GUS染色对橡胶树转基因植株进行初期的阳性鉴定。结果表明,在59份转基因再生植株中,两对特异引物的PCR扩增结果与GUS染色检测结果一致,其中37株仍然表现为阳性,而22株却检测不到目的基因的存在以及GUS基因的表达,表现为外源基因的丢失。因此,初步推测低选择压造成了早期阳性胚状体在长期的连续继代培养再生植株的过程中发生了外源基因的丢失现象,并结合现有的研究提出了初步的解决措施。