异源四倍体油菜HAKs家族核心基因的鉴定及其功能初步解析

[目的]HAKs家族基因编码高亲和力K^(+)转运蛋白,在K^(+)吸收和运输过程中发挥关键作用。鉴定甘蓝型油菜HAKs家族核心基因,研究不同养分胁迫下核心基因表达的响应,不仅可加深对HAKs功能的理解,也可为HAKs介导油菜营养胁迫抗性的遗传改良提供基因资源参考。[方法]对甘蓝型油菜HAKs基因家族进行全基因组鉴定和分析,其中包括系统发育关系、基因结构、保守基序、染色体定位、顺式作用元件。利用不同养分胁迫下的转录组数据对HAKs家族基因进行差异基因表达分析,并用Cytoscape构建共表达网络图。以低钾抗性品系“H280”和低钾敏感品系“L49”为材料,在低钾胁迫下进行水培试验,使用ICP-MS分析了“H280”和“L49”根部K+含量,RT-qPCR以及亚细胞定位分析了低钾胁迫下BnaA7.HAK5的响应和功能。[结果]在甘蓝型油菜中共鉴定到40个HAKs家族成员。对其进行进化关系分析,发现它们的Ka/Ks值均小于1.0。顺式作用元件分析表明,MYB和激素响应顺式作用调控元件ABRE在HAKs家族基因的启动子区域高度富集。共线性分析表明在进化过程中,甘蓝型油菜中绝大多数的HAKs基因保存完整。差异表达基因分析发现,大部分HAKs家族基因的表达水平受低钾胁迫的显著诱导。共表达网络分析表明,BnaA7.HAK5响应油菜低钾胁迫。RT-qPCR结果显示,BnaA7.HAK5在抗低钾品系“H280”根中的表达量显著高于低钾敏感品系“L49”。亚细胞定位结果显示,BnaA7.HAK5定位在细胞质膜上。[结论]甘蓝型油菜共有40个BnaHAKs基因,BnaHAKs基因响应低钾或盐等养分胁迫。定位在细胞质膜上的BnaA7.HAK5在低钾条件下的表达量显著上调,且在“H280”和“L49”油菜品系根部的表达量差异显著,表明BnaA7.HAK5在油菜高亲和性钾离子的吸收和转运中发挥重要功能。

油菜ABCC家族基因生物信息学分析及其对镉胁迫的转录响应

为进一步解析ABCC家族基因在甘蓝型油菜中的生物学功能及其对土壤镉污染的响应,对在甘蓝型油菜中鉴定到的38个ABCC同源基因,从系统进化、染色体定位、基因结构以及对镉胁迫的转录响应方面进行分析。结果表明,甘蓝型油菜ABCC家族基因的进化分支都归属于拟南芥ABCC家族相应的分支,但ABCC9亚家族在甘蓝型油菜中缺失;大部分成员均属于较稳定的疏水蛋白;Ka/Ks值均小于1,受到强烈的纯化选择作用;基因结构变异较大,内含子数目在6~34之间,启动子区域能结合多种顺式作用元件,其中Dof丰度最大。38个BnaABCC分别定位在7条A染色体和8条C染色体上。共线性分析结果表明,甘蓝型油菜和拟南芥、白菜、甘蓝存在大量的同源基因。转录组分析显示,甘蓝型油菜ABCC家族基因受到镉胁迫的强烈诱导,其中BnaC1.ABCC3-2和BnaA6.ABCC4-3被分别确定为地上部和根部的主效基因。

油菜盐胁迫响应miRNA及其靶基因鉴定

油菜是世界上重要的油料作物之一,然而土壤盐胁迫严重抑制油菜的生长发育和籽粒产量。前人研究表明,在盐胁迫下,植物通过表达一些miRNA,并调控其靶基因的表达,进而提高植物自身的盐胁迫抗性。本研究分别在200 mmol·L^(-1) NaCl处理(T)和对照(C)条件下培养油菜,取其地上部(S)和根(R)构建了12个小RNA文库进行高通量测序。通过对全基因组的miRNA进行差异表达分析,一共鉴定到了26个差异表达的miRNA,并预测了171个相应的靶基因。结合前期转录组的基因差异表达以及本研究的miRNA差异表达结果,推测miRNA156-SPL15-WRKY、miRNA397-LAC12-木质素、miR169-NFYA5和miR399-UBC29-泛素化等通路可能参与了油菜盐胁迫抗性调控。本研究所鉴定的miRNA及其核心靶基因丰富了油菜盐胁迫抗性的表观调控机制,并为油菜盐胁迫抗性的遗传改良提供了优异的基因资源。

甘蓝型油菜铵转运蛋白基因家族成员的鉴定与表达分析

了解异源四倍体甘蓝型油菜中AMT基因家族的功能,为进一步克隆和利用基因改良甘蓝型油菜的氮素利用效率和铵毒抗性提供一定的理论基础。利用生物信息学的方法鉴定出20个BnaAMTs基因,其中14个为AMT1亚家族成员,6个为AMT2亚家族成员,它们不均匀地分布在油菜的12条染色体上。进化与保守基序分析结果表明,BnaAMTs蛋白亚家族内的蛋白质序列保守性较高,但亚家族之间的差异较大。BnaAMTs基因在油菜不同组织中的表达谱显示,该基因家族表达具有组织特异性。利用转录组测序结果分析发现,根部在供应高浓度的铵态氮和硝态氮时,BnaA7.AMT1;3表达量最高;在硝态氮缺乏条件下,BnaA5.AMT1;1表达量最高;在上述几种处理下,BnaC6.AMT1;1都是地上部表达量最高的拷贝。在缺硼或缺磷条件下,油菜BnaAMTs基因整体呈现表达上升的趋势;但在盐胁迫条件下,表达量下降;镉胁迫对BnaAMTs基因的表达影响较小。这些基因可能在铵态氮与其他必需营养元素的互作、镉胁迫、盐胁迫等逆境响应中发挥一定的作用;并为进一步深入解析甘蓝型油菜AMT家族基因的分子功能奠定了基础。

甘蓝型油菜NRT1.5和NRT1.8家族基因的生物信息学分析及其对氮-镉胁迫的响应

植物对硝酸盐的吸收和转运需要硝酸盐转运体(nitratetransporters,NRTs)的协助。在拟南芥中,硝酸盐的长途转运及其在根部和地上部的分配,主要受NRT1家族的两个成员NRT1.5和NRT1.8的协同调控,且两者的表达均受到硝酸盐的强烈诱导。本文以AtNRT1.5和AtNRT1.8基因序列为基础序列,采用生物信息学方法鉴定了白菜、甘蓝和甘蓝型油菜中NRT1.5和NRT1.8同源基因,并对基因结构和分子特性、基因拷贝数变异、基因染色体分布、系统进化树、蛋白保守序列比对和跨膜结构域、基因响应低氮和镉胁迫的转录组测序以及基因共表达网络进行了分析。结果表明,白菜、甘蓝及甘蓝型油菜中NRT1.5和NRT1.8蛋白均含有保守的跨膜结构域和保守基序(F-Y-L-A-L-N-LG-S-L),属于MFS (major facilitator superfamily)超家族的小肽转运体PTR (peptide transporter)家族。转录组测序结果表明,甘蓝型油菜低氮处理72 h,根部NRT1.5基因的表达丰度上调而抑制NRT1.8的表达;镉处理条件下,乙烯/茉莉酸-硝酸盐转运体介导的信号途径能够促进NRT1.8表达上调而抑制NRT1.5的表达,从而使更多的硝酸盐从地上部运输到根部,提高植物抗镉胁迫的能力。本研究为进一步了解甘蓝型油菜NRT1.5和NRT1.8家族基因的生物学功能及其对氮-镉胁迫的响应奠定基础,同时为NRT1.5和NRT1.8家族基因在其他物种中的生物信息学研究提供参考。

甘蓝型油菜PIN家族基因的鉴定与生物信息学分析

PIN家族基因是一类调控植物生长素极性运输的重要载体元件,PIN基因编码生长素输出蛋白,介导生长素在植物体的运输,然而在基因组较复杂的甘蓝型油菜中缺乏系统研究。本研究运用生物信息学方法在甘蓝型油菜全基因组数据库筛选甘蓝型油菜PIN家族基因,对鉴定出的29个Bn PINs基因开展拷贝数变异、分子特征、跨膜结构域、保守基序、染色体定位、系统进化树构建、PIN蛋白二级结构及三级结构预测等研究,结合高通量转录组测序进行低氮胁迫下的转录水平分析。结果表明,甘蓝型油菜PIN家族基因拷贝数明显多于拟南芥、甘蓝和白菜所具有的PIN家族基因数量;Bn PINs蛋白多属于由碱性氨基酸组成的稳定蛋白,含有保守的N末端结构域,二级结构与拟南芥PIN蛋白相似;系统进化选择能力分析表明,Bn PINs基因与甘蓝和白菜PIN家族基因进化关系相近。转录组测序表明,Bn PIN1s、Bn PIN2s、Bn PIN3s基因主要在甘蓝型油菜根部表达且受长期低氮(72 h)诱导,Bn PIN6s和Bn PIN8s基因主要在地上部表达,低氮会抑制Bn PIN6s表达。本研究结果为进一步研究甘蓝型油菜PIN家族基因生物学功能尤其是在响应低氮胁迫中的功能奠定基础,为已知大量数据的其他物种家族基因生物信息学研究提供参考。

植物液泡膜H^+-ATPase和H^+-PPase 研究进展

植物液泡膜ATP酶(H^+-ATPase)和液泡膜焦磷酸酶(H^+-PPase)是液泡膜上两个含量丰富的蛋白,其功能的正常发挥在植物生长发育过程中扮演着重要角色。液泡膜H^+-ATPase和H^+-PPase水解底物释放能量,同时产生大量H^+由胞质泵入液泡内,形成细胞质与液泡间的H^+电化学势梯度,为多种溶质分子的跨膜主动运输提供驱动力,维持细胞内的离子稳态和渗透平衡,为细胞内各种生理生化反应的正常运行提供保障。此外,液泡作为植物细胞离子养分的储存库,其膜上H^+-ATPase和H^+-PPase能够通过改变其活性来调控硝酸盐在胞质和液泡间的分配比例,进而影响植物的氮素利用效率。在逆境胁迫条件下,提高液泡膜H^+-ATPase和H^+-PPase的活性有利于提高植株对逆境的适应能力,从而减少逆境胁迫对植株生长发育造成的不利影响。介绍了植物液泡膜H^+-ATPase和H^+-PPase的结构特征及其在植物生长发育过程中的生理功能,并对其在植物抵御非生物逆境胁迫过程中发挥的重要作用进行阐述,为进一步提高作物的氮素利用率及逆境适应能力提供方向。

油菜脯氨酸代谢基因家族的生物信息学分析与核心成员鉴定

脯氨酸积累是植物在生物和非生物胁迫下的一种重要的代谢适应性机制。吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)、吡咯啉-5-羧酸还原酶(P5CR)酶、脯氨酸脱氢酶(PDH)、吡咯啉-5-羧酸脱氢酶(P5CDH)是依赖谷氨酸的脯氨酸生物合成途径中的关键酶。油菜是世界上重要的油料作物,在油菜生长发育过程中,其时常遭受各类生物和非生物胁迫。然而迄今为止,在异源四倍体油菜中缺乏关于这些脯氨酸代谢基因家族的系统分析报道。本研究利用甘蓝型油菜‘中双11’基因组注释信息,分别鉴定到上述10个BnaP5CSs、6个BnaP5CRs、8个BnaPDHs以及3个BnaP5CDHs基因。这些基因家族在系统发育上分为不同的进化分支,同一亚组中的成员具有相似的理化特性、基因/蛋白质结构和保守的基序。进化压力分析表明,这些基因均遭受了强烈的纯化选择。启动子区的顺式作用元件分析揭示了油菜上述4类基因家族之间均存在共同的和特异的转录调控机制。本研究分别对‘中双11’油菜幼苗进行盐胁迫、低钾、低磷以及铵毒胁迫处理,分别取地上部及根部进行转录组测定与分析。结果显示,脯氨酸合成相关基因的表达水平在上述4种胁迫下普遍上调,而调控脯氨酸降解基因的表达水平则在盐胁迫和低磷胁迫情况下调;基因共表达分析显示BnaC4.P5CS1a、BnaA5.P5CS1等基因可能在脯氨酸介导的油菜逆境响应网络中发挥核心作用。本研究通过脯氨酸代谢基因家族的生物信息学鉴定以及多种非生物逆境下的转录特征分析,将为深入研究脯氨酸介导的逆境抗性提供理论依据,也将为脯氨酸介导油菜非生物胁迫抗性的遗传改良提供优异的基因资源。

CACTFTPPCA1(YACT)、Dof(AAAG)、MYB可能参与甘蓝型油菜对氮胁迫的响应

【目的】油菜需氮量高但氮素利用率低,氮素源库分配效率被认为是调控植物氮素利用效率的关键因子。在拟南芥中,NRT1.7基因介导了植物韧皮部硝酸盐由衰老叶片向幼嫩叶片和角果中的再转运过程。通过分析鉴定油菜中的NRT1.7基因及其对供氮水平的响应,为进一步系统研究NRT1.7基因提供参考依据。【方法】以AtNRT1.7基因序列为基础序列,采用生物信息学方法鉴定了白菜、甘蓝和甘蓝型油菜中NRT1.7的同源基因,预测和分析了该基因拷贝数、系统进化、进化选择压力、分子特征、保守基序、跨膜结构域、染色体定位、基因结构及其启动子区域所能结合的顺式作用元件,同时采用荧光定量PCR分析了甘蓝型油菜BnaNRT1.7s的组织表达模式及其对氮胁迫的响应。氮素响应试验以甘蓝型油菜幼苗为材料,在NO3-N 9.0 mmol/L溶液中培养10天后,直接测定NRT1.7基因表达量;转入NO3--N 0.3 mmol/L溶液中(低氮胁迫)或在无氮溶液中饥饿处理3天后,恢复NO3-N 9.0 mmol/L溶液培养,再测定NRT1.7基因表达量。【结果】甘蓝型油菜NRT1.7s家族包含6个成员,系统进化分析表明BnaNRT1.7s与拟南芥进化相似,分布在相近的分支。BnaNRT1.7s家族所有基因成员的Ka/Ks值均小于1.0,受到强烈的纯化选择作用。BnaNRT1.7s家族所有基因成员均属于稳定的两性蛋白,含12~13个跨膜结构域。基因结构相似,均含有3个内含子,且CACTFTPPCA1(YACT)、Dof(AAAG)、MYB是启动子上丰度较大的顺式作用原件,可能参与了植物对氮素的响应。实时荧光定量PCR结果表明,甘蓝型油菜中NRT1.7基因会受到不同氮素水平的调控。长期(72 h)低氮处理,根部BnaA7.NRT1.7b和BnaC6.NRT1.7b基因的表达上调而抑制地上部BnaCn.NRT1.7基因的表达,共同调控植物对低氮胁迫的适应能力。氮饥饿3天后供氮6 h,地上部和根部BnaNRT1.7的基因表达均受到抑制。基因共表达网络分析显示,低氮胁迫下,BnaCn.NRT1.7和BnaC6.NRT1.7b基因分别在地上部和根部氮素再分配中起主导作用。【结论】甘蓝型油菜NRT1.7蛋白进化过程相对保守,基因结构相似,启动子上的顺式作用原件CACTFTPPCA1(YACT)、Dof(AAAG)、MYB可能参与了甘蓝型油菜对氮胁迫的响应。

甘蓝型油菜AVP1、VHA-a2和VHA-a3基因的鉴定及功能性研究

液泡是调控植物细胞分化、生长发育的重要部位,AVP1、VHA-a2和VHA-a3基因调控植物液泡内外离子平衡、离子运输以及能量供应。本研究利用功能已知的拟南芥AVP1、VHA-a2和VHA-a3基因为参考序列在甘蓝型油菜全基因组数据库、NCBI植物基因组注释数据库等鉴定并筛选出9个BnaAVP1、3个BnaVHA-a2和4个BnaVHA-a3,并分析基因拷贝数变异、分子特征、跨膜结构域、保守基序、染色体定位、系统进化树构建、蛋白二级结构及三维结构预测、高通量转录组测序等。发现甘蓝型油菜BnaAVP1和BnaVHA-a3的基因数量明显多于甘蓝和白菜;甘蓝型油菜AVP1、VHA-a2和VHA-a3蛋白属于由酸性氨基酸组成的稳定蛋白;系统进化选择能力的分析表明,甘蓝型油菜AVP1、VHA-a2和VHA-a3家族基因与甘蓝、白菜关系相近。转录组测序表明,低氮处理后,BnaAVP1s基因主要在地上部表达,且低氮3h后地上部表达下调,低氮处理72h根中表达量上调;BnaVHA-a2s和BnaVHA-a3s基因在地上部和根中均有表达,BnaVHA-a2s在低氮处理72h后表达量基本呈上调趋势,BnaVHA-a3s在低氮3h后基本呈下调趋势。低磷处理后,BnaAVP1s根中大部分基因表达上调,地上部表达基本无差异;BnaVHA-a2s表达基本无差异;BnaVHA-a3s地上部和根中均基本为上调趋势。该结果为进一步研究甘蓝型油菜AVP1、VHA-a2和VHA-a3基因生物学功能及AVP1、VHA-a2和VHA-a3蛋白水解ATP提供能量供植物代谢的分子机制奠定基础,为已知大量数据的其他物种家族基因生物信息学研究提供参考。

甘蓝型油菜钙离子转运蛋白CAX家族基因生物信息学及其对镉胁迫响应表达分析

CAXs(Cation/H+ exchanger antiporter)是一类重要的阳离子跨膜转运蛋白,在调控植物Ca2+平衡,参与转运金属离子Cd2+和Mn2+中发挥了重要作用,但在甘蓝型油菜中尚缺乏系统研究。本文利用生物信息学的方法对甘蓝型油菜CAX家族成员的基因拷贝数、系统进化、进化选择压力、分子特征、保守基序、染色体定位、基因结构及其启动子区域所能结合的顺式作用元件进行了预测和分析;同时采用荧光定量PCR分析了甘蓝型油菜BnaCAXs的组织表达模式及其对Cd2+胁迫的响应。结果表明,甘蓝型油菜CAX家族共包含17个成员,系统进化分析结果表明BnaCAXs与拟南芥进化相似,并且明显地分为5个亚家族。BnaCAXs家族所有基因成员的Ka/Ks值均小于0.3,受到强烈的纯化选择作用。大部分BnaCAXs均属于稳定的疏水蛋白,并包含8~11个跨膜结构域。基因结构差异明显,内含子数目从6~11不等,并且Dof、MYB以及W-BOX是其启动子上丰度较大的顺式作用元件,可能参与到BnaCAX抗逆过程的调控。荧光定量PCR结果表明,甘蓝型油菜CAX基因主要在地下部表达;BnaC4.CAX1-2和BnaC3.CAX2-2是该家族的核心基因,并受到Cd2+胁迫的显著诱导。