新型Na^(+)/H^(+)逆向转运蛋白UPF0118的Na^(+)结合鉴定

UPF0118蛋白是一种新型Na^(+)(Li^(+))/H^(+)逆向转运蛋白,属于AI-2E超家族,目前已被划分至Na^(+)/H^(+)逆向转运蛋白亚家族,但无直接证据表明该蛋白可与Na+产生相互作用。为鉴定UPF0118蛋白是否具有Na^(+)结合功能,利用PCR技术扩增upf0118基因编码序列,通过Eco RⅠ和PstⅠ酶切位点构建至原核表达载体p ETDuet-1,转化至E. coli BL21*(DE3),对诱导后大量表达的蛋白进行Ni^(2+)亲和层析和凝胶过滤层析,利用等温滴定量热技术对纯化蛋白进行滴定。结果表明,在pH 5.5条件下,Na^(+)滴入导致蛋白溶液产生明显放热现象。在pH 5.5条件下该蛋白具有Na^(+)结合功能,证明该蛋白Na+结合功能为其功能单元与分子机制的研究奠定基础。

大肠杆菌Zn2+敏感突变株构建及其功能验证

【背景】Zn^(2+)在细胞解毒及许多生理过程中发挥着关键作用,Zn^(2+)转运蛋白已逐渐引起人们的重视。在大肠杆菌中,zntA和zitB是2个外排Zn^(2+)的关键基因。【目的】构建大肠杆菌Zn^(2+)敏感突变株,并对其功能进行验证。【方法】以Escherichia coli DH5α为出发菌株,利用λRed重组系统,通过携带卡那霉素抗性基因的同源重组片段敲除zntA基因。在单基因敲除菌株基础上,利用携带庆大霉素抗性基因的同源重组片段敲除zitB基因,获得一株敲除了zntA和zitB的双基因敲除菌株KZAB04。通过功能互补实验检测基因敲除菌株及对照菌株对不同浓度Zn^(2+)的敏感程度。【结果】基因敲除菌株KZAB04比出发菌株E.coli DH5α具有更高的Zn^(2+)敏感性。【结论】大肠杆菌Zn^(2+)敏感突变株构建成功。该菌株的构建为zntA和zitB基因功能的研究提供了必要条件,同时也为其他Zn^(2+)转运蛋白基因的功能鉴定与分析奠定了基础。