基于UPLC-LTQ-Orbitrap-MS和网络药理学探讨石榴花改善脂质沉积的作用机制

目的:探讨石榴花改善脂质沉积(lipid deposition,LD)的作用机制。方法:CCK-8法测定石榴花提取物(pomegranate flower extract,PFE)及棕榈酸(palmitic acid,PA)对细胞活力的影响,采用PA诱导HepG2细胞LD模型,实验分为PFE组、空白组(NC组)和模型组(PA组),油红O染色法测定细胞内脂质含量,GPO-PAP法测定细胞内总胆固醇(total cholesterol,TC)和甘油三酯(triglyceride,TG)含量。UPLC-LTQ-Orbitrap-MS技术鉴定差异代谢物并进行代谢通路富集。采用网络药理学方法筛选关键成分与核心靶点,并进行GO和KEGG富集分析。利用Autodock软件对关键成分与核心靶点进行分子对接,采用q-PCR检测PIK3CA、AKT1、MAPK、STAT3 mRNA的表达。结果:与NC组比较,PA组细胞内脂质、TC、TG含量显著升高(P<0.01),33种代谢物有显著差异(P<0.05);与PA组比较,PFE组细胞内脂质、TC、TG含量显著降低(P<0.05),10种代谢物显著回调(P<0.05)。33种差异代谢物富集到与LD关联性强的甘油磷脂代谢通路。网络药理学得到PF的关键成分为白桦脂酸、木犀草素等,核心靶点为MAPK1、PIK3CA、AKT1、STAT3等。交集靶点主要通过调控PI3K-AKT、HIF-1等信号通路发挥治疗作用。关键成分与核心靶点均有较好的结合能力。q-PCR实验表明PFE可抑制HepG2细胞中MAPK、PIK3CA、AKT1 mRNA表达,促进STAT3的mRNA表达。结论:石榴花可改善HepG2细胞LD,代谢组学和网络药理学发现其作用机制可能与调节甘油磷脂代谢、MAPK、STAT3基因表达及PI3K-AKT等信号通路有关。

石榴花对棕榈酸诱导的HepG2细胞脂质沉积的改善作用及机制研究

目的 探讨石榴花提取物(Punica granatum flower extract,PFE)及其活性成分白桦脂酸和木犀草素对棕榈酸诱导的人肝癌HepG2细胞脂质沉积的改善作用和作用机制。方法 通过CCK-8法测定棕榈酸、辛伐他汀、PFE、白桦脂酸和木犀草素对HepG2细胞活力的影响,以确定后续给药剂量。利用500μmol/L棕榈酸建立HepG2细胞脂质沉积模型,同时给予PFE(50、100、200 mg/L)、白桦脂酸(40、80、160μmol/L)、木犀草素(40、80、160μmol/L)进行干预,采用油红O染色法测定细胞内脂质含量;GPO-PAP法测定细胞内三酰甘油(triglyceride,TG)和总胆固醇(Total cholesterol,TC)含量;流式细胞仪检测早、晚期凋亡细胞率;Western blotting检测凋亡因子B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)及磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt)、Janus激酶2/信号传导及转录激活因子3(Janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3,JAK2/STAT3)通路相关蛋白表达;qRT-PCR测定PI3K、Akt、JAK2、STAT3的m RNA表达。结果 选取对细胞活力无显著影响的PFE(50、100、200 mg/L)、白桦脂酸(40、80、160μmol/L)和木犀草素(40、80、160μmol/L)进行后续实验。与对照组比较,模型组细胞内脂质、TC和TG含量均显著升高(P<0.001),细胞凋亡率显著升高(P<0.001),PI3K、Akt、Bax蛋白和PI3K、Akt mRNA表达水平均显著升高(P<0.001),JAK2、STAT3、Bcl-2蛋白和JAK2、STAT3 mRNA表达水平均显著下降(P<0.001)。与模型组比较,各给药组细胞内脂质、TC和TG含量均显著降低(P<0.05、0.01、0.001),细胞早、晚期凋亡率显著下降(P<0.01、0.001),细胞中PI3K、Akt、Bax蛋白和PI3K、Akt m RNA表达水平均显著降低(P<0.05、0.001),JAK2、STAT3蛋白和m RNA表达水平均显著升高(P<0.05、0.01、0.001),PFE组和白桦脂酸组Bcl-2蛋白表达水平均显著升高(P<0.01、0.001)。结论 PFE、白桦脂酸和木犀草素能够改善棕榈酸诱导的HepG2细胞脂质沉积,其作用机制与抑制游离脂肪酸诱导的细胞凋亡、调控PI3K/Akt和JAK2/STAT3通路有关。