幼虫、青年和成年日本医蛭不同生长阶段差异表达基因比较分析

【目的】筛选出调控日本医蛭生长发育的相关基因,揭示其生长发育、繁殖和抗凝分子机制,为后期开展日本医蛭养殖、生长发育及相关功能基因研究提供科学依据。【方法】以幼虫期(孵化10 d以内,HNL)、青年虫期(孵化后2个月左右,HNY)和成年虫期(孵化后2年左右,HNA)的日本医蛭为研究对象,利用Illumina HiSeq 4000平台对构建的cDNA文库进行转录组测序,按错误发现率(FDR)<0.05和|log2FC|>1的原则筛选差异表达基因(DEGs),并进行GO功能注释分析和KEGG信号通路富集分析。【结果】使用3个时期的样本构建24个cDNA文库,共产生541124257条原始序列(Raw reads),经Fastp质量控制及RNA-Seq组装,共获得20430个mRNAs转录本,并注释出88个新的mRNAs转录本。通过对日本医蛭不同生长阶段进行两两对比,共获得1348个差异表达基因,其中,在幼虫期—青年虫期(HNL vs HNY)中获得238个差异表达基因,在幼虫期—成虫期(HNL vs HNA)中获得976个差异表达基因,在青年虫期—成虫期(HNY vs HNA)中获得763个差异表达基因。幼虫期—成虫期的差异表达基因主要富集蛋白水解、肌球蛋白复合体、细胞骨架、几丁质代谢过程及对伤害的反应等GO功能条目上,以及苯丙氨酸/酪氨酸/色氨酸生物合成、丙烯酰胺转移酶等KEGG信号通路上。说明日本医蛭幼虫在生长过程中大量摄食并通过消化、代谢和合成物质为自身发育提供能量,而成年日本医蛭发育成熟后与其生长发育相关的代谢过程下调,且已适应环境,对于环境刺激的敏感度也有所降低。【结论】在幼虫期—成虫期(HNL vs HNA)获得的976个差异表达基因中,上调差异表达基因主要与肌肉发育相关,而与性腺发育或产卵调节及神经发育相关的差异表达基因具有明显周期特异性,其表达变化均与日本医蛭的生长发育有关。水蛭素和抗凝相关基因在青年期高表达,因此开展水蛭抗凝血能力研究时宜选用青年日本医蛭。

卵泡液外泌体miRNA对颗粒细胞糖酵解途径介导多囊卵巢综合征患者卵泡发育的影响及其作用机制

目的 评价卵泡液(follicular fluid,FF)外泌体miRNA对颗粒细胞(granulosa cells,GCs)糖酵解途径介导的多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)患者卵泡发育的影响,并探讨其作用机制。方法 招募3名PCOS不孕患者和3名非PCOS不孕患者,测定2组患者在促排卵前的基线激素水平,通过短效长方案促排卵并穿刺取双侧FF,超速离心法收集外泌体,采用透射电镜进行鉴定。Trizol法提取外泌体总RNA,构建文库,进行miRNA测序及质控处理后,与参考基因组GRCh38进行比对。利用聚类Profiler R包进行差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)的GO注释分析和KEGG通路分析。应用Omnipath数据库对miRNA进行互作分析。随机抽取16个miRNA,通过qPCR检测,验证miRNA测序结果的准确性。结果 与非PCOS组比较,PCOS组的黄体生成素(luteinizing hormone,LH)、抗缪勒管激素(anti-Mullerian hormone,AMH)、睾酮(testosterone)、窦卵泡数显著高于非PCOS组(t=2.479~9.163,P均<0.05)。2组FF外泌体边缘均清晰,中央淡染的杯口状囊泡,直径为100~150 nm,结构完整,外泌体浓度约为8×10^(10)particles/mL。miRNA测序共检测到928个miRNA,与非PCOS组比较,POCS组外泌体中共筛选出59个差异miRNA(DEmiRNA),其中31个上调,28个下调,且qPCR法检测的基因表达差异趋势与miRNA测序结果高度相似。在PCOS患者FF外泌体中,通过miRNA调控mRNA,可显著改变GCs糖酵解效率和细胞凋亡状态。PKM、PFKL、HK2是miRNA调节GCs糖酵解的关键靶基因,SLC2A1是miRNA调节GCs凋亡的关键靶基因。结论 PCOS患者FF外泌体miRNA可使GCs糖酵解减弱,并加速其凋亡,从而减少ATP及乳酸的产生,导致卵泡发育障碍。

菲牛蛭在幼年、青年和成年不同生长阶段差异表达基因比较研究

医用水蛭被广泛用于生化和临床医学研究,但关于菲牛蛭(Poecilobdella manillensis)不同生长阶段的差异表达基因研究却鲜有报道。本研究通过转录组分析比较了水蛭在幼年期(larval,L)、青年期(young,Y)和成年期(adult,A)不同生长阶段的基因表达模式。使用三个时期的样本构建了24个cDNA文库,测序得到了54639118条序列,组装了18106个mRNA转录本并注释出958个新的mRNA转录本。从这些转录本中共鉴定3356个差异表达基因,包括L vs Y的1700个、Y vs A的320个和L vs A的2799个差异表达基因,其中有47个共有的差异表达基因。对差异表达基因进行时间序列分析得到9个表达簇,其中5个有整体上调趋势,4个有整体下调趋势。进一步的GO和KEGG富集分析结果显示,幼年期和成年期差异上调基因富集在纤毛、肌纤维、收缩纤维等GO通路中,KEGG通路中富集于细胞骨架蛋白、扩张型心肌病、心肌细胞的肾上腺素信号传导等通路。研究还发现菲牛蛭的细胞脂质代谢,以及对营养物质和刺激的敏感性随着生长发育逐渐降低,这些变化解释了菲牛蛭处于幼年时期需要大量的能量用于肌肉组织和器官发育,而当菲牛蛭成熟后降低了能量代谢和对外界刺激的敏感性,为菲牛蛭对环境的适应提供了帮助,提高了生存概率。菲牛蛭素(HIRM2)在成年阶段的表达量明显上调,这为成年菲牛蛭(而非青年期菲牛蛭)广泛用于临床治疗和中医药提供了重要线索。