低温对小胶质细胞氧糖剥夺/复糖复氧时细胞极化及TLR4/NF-κB信号通路的影响

目的评价低温对小胶质细胞氧糖剥夺/复糖复氧(OGD/R)时细胞极化及TLR4/NF-κB信号通路的影响。方法体外培养BV2小胶质细胞,采用随机数字表法分为3组(n=18):对照组(C组)、OGD/R组和OGD/R+低温组(OGD/R+HT组)。C组正常培养24 h,OGD/R组氧糖剥夺2 h后复糖复氧24 h,低温组在33℃低温培养箱中对细胞进行氧糖剥夺2 h复糖复氧24 h处理。采用CCK-8法检测细胞存活率,分别采用免疫荧光及RT-qPCR法检测M1型小胶质细胞标志物CD32、iNOS及其mRNA、M2型小胶质细胞标志物CD206、Arg-1及其mRNA的表达,分别采用Western blot法和RT-qPCR法检测TLR4、NF-κB及其mRNA的表达,采用ELISA法检测细胞上清液TNF-α、IL-1β及IL-10浓度。结果与C组比较,OGD/R组和OGD/R+HT组细胞存活率下降,CD32、iNOS、CD206、Arg-1、TLR4、NF-κB及其mRNA表达上调,上清液TNF-α、IL-1β及IL-10浓度升高(P<0.05);与OGD/R组比较,OGD/R+HT组细胞存活率升高,CD32、iNOS、TLR4和NF-κB及其mRNA表达下调,CD206、Arg-1及其mRNA表达上调,上清液TNF-α、IL-1β浓度降低,IL-10浓度升高(P<0.05)。结论低温可明显抑制小胶质细胞OGD/R时向M1型极化,并增加M2型水平,抑制炎症反应,其机制可能与抑制TLR4/NF-κB信号通路有关。

M2型小胶质细胞源性外泌体与小鼠神经元氧糖剥夺/复糖复氧损伤的关系

目的评价M2型小胶质细胞源性外泌体(M2-exo)与小鼠神经元氧糖剥夺/复糖复氧(OGD/R)损伤的关系。方法体外培养小鼠神经母细胞(N2a细胞)及BV2小胶质细胞,采用20 ng/ml IL-4将BV2小胶质细胞激活为M2型,提取M0型小胶质细胞源性外泌体(M0-exo)和M2-exo。采用随机数字表法将N2a细胞分为4组(n=23):对照+M0-exo组(C+M0组)、对照+M2-exo组(C+M2组)、OGD/R+M0-exo组(O+M0组)和OGD/R+M2-exo组(O+M2组)。C+M0组和C+M2组分别加入M0-exo和M2-exo(终浓度100μg/ml)孵育24 h,O+M0组和O+M2组于氧糖剥夺3 h时分别加入M0-exo和M2-exo(终浓度100μg/ml),再复糖复氧24 h。采用CCK-8法检测N2a细胞活力,采用LDH释放率评估细胞损伤程度,采用Western blot法及实时q-PCR检测Bax和Bcl-2及其mRNA表达。结果与C+M0组比较,C+M2组N2a细胞活力、LDH释放率、Bax/Bcl-2比值和Bax mRNA/Bcl-2 mRNA比值差异无统计学意义(P>0.05),O+M0组N2a细胞活力下降,LDH释放率、Bax/Bcl-2比值和Bax mRNA/Bcl-2 mRNA比值升高(P<0.05)。与C+M2组比较,O+M2组N2a细胞活力下降,LDH释放率、Bax/Bcl-2比值和Bax mRNA/Bcl-2 mRNA比值升高(P<0.05)。与O+M0组比较,O+M2组N2a细胞活力升高,LDH释放率、Bax/Bcl-2比值和Bax mRNA/Bcl-2 mRNA比值降低(P<0.05)。结论M2-exo在小鼠神经元OGD/R过程中发挥内源性保护作用,可能与抑制细胞凋亡有关。

小胶质细胞及其外泌体在中枢神经退行性疾病中的研究进展

小胶质细胞广泛存在于中枢神经系统,参与各种病理生理过程,在阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿舞蹈症等退行性疾病中发挥重要作用。近几年,对于小胶质细胞活化产生的外泌体参与各种疾病的病理生理过程的研究备受关注,但外泌体的作用并未完全明确。本文主要对于小胶质细胞的特点、功能、小胶质细胞源性外泌体的特点和功能及其在中枢神经退行性疾病中的作用进行综述。

M1型小胶质细胞源性外泌体携载miR-20a-5p对氧糖剥夺/复氧后神经元损伤的影响

目的探讨M1型小胶质细胞源性外泌体(M1-exo)对氧糖剥夺/复氧后神经元损伤的影响,并研究其作用机制。方法取对数期生长的小鼠小胶质细胞BV2,加入100μg/L脂多糖(LPS)和20μg/Lγ-干扰素(IFN-γ)诱导小胶质细胞极化为M1表型,通过蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)、实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)、免疫荧光法鉴定M1型小胶质细胞。收取M1型小胶质细胞的上清液,用ExoQuick-TCTM试剂盒提取M1-exo,通过透射电镜及纳米颗粒粒径分析(NTA)观察外泌体形态,采用Western blotting法检测外泌体标记蛋白白细胞分化抗原(CD9、CD63)的表达。将生长良好的小鼠神经母细胞瘤细胞N2a分为6组:C组细胞常规培养;O组氧糖剥夺3 h后复糖复氧24 h制备N2a细胞氧糖剥夺/复氧损伤模型;E组的N2a细胞氧糖剥夺3 h后复糖复氧并与M1-exo共培养24 h;NC组、M组和I组分别构建阴性对照、过表达和敲低微小RNA-20a-5p(miR-20a-5p)的M1-exo,通过qPCR检测转染是否成功。NC组、M组和I组N2a细胞氧糖剥夺3 h后,与转染后的M1-exo共培养24 h后检测各项指标。采用细胞增殖检测试剂(CCK-8)法检测细胞活力,采用流式细胞术检测细胞凋亡,采用qPCR法检测miR-20a-5p表达。结果与M0型小胶质细胞相比,M1型小胶质细胞特异性标志物CD32和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)荧光强度及其mRNA和蛋白表达均明显升高〔CD32(荧光强度):36.919±1.541比3.533±0.351,CD32 mRNA(2^(-ΔΔCt)):4.887±0.031比1.003±0.012,CD32/β-actin:2.663±0.219比1.000±0.028;iNOS(荧光强度):29.513±1.197比7.933±0.378,iNOS mRNA(2^(-ΔΔCt)):4.829±0.177比1.000±0.016,iNOS/β-actin:1.991±0.035比1.000±0.045;均P<0.01〕,证明M1型小胶质细胞被成功激活。电镜下可见M1-exo为圆形或卵圆形囊泡状小体,并有明显膜性结构,直径范围约100 nm。Western blotting结果显示,M1-exo表达特异性CD63和CD9蛋白。与C组比较,O组N2a细胞活力明显下降,细胞凋亡率和miR-20a-5p的表达明显升高〔细胞活力(A值):0.540±0.032比1.001±0.014,细胞凋亡率:(19.857±0.910)%比(13.508±0.460)%,miR-20a-5p(2^(-ΔΔCt)):5.508±0.291比1.033±0.101,均P<0.01〕。与O组比较,E组N2a细胞活力明显下降,细胞凋亡率和miR-20a-5p表达进一步升高〔细胞活力(A值):0.412±0.029比0.540±0.032,细胞凋亡率:(31.802±0.647)%比(19.857±0.910)%,miR-20a-5p(2^(-ΔΔCt)):8.912±0.183比5.508±0.291,均P<0.01〕,说明M1-exo进一步加重了氧糖剥夺/复氧后N2a细胞的损伤。与E组比较,M组N2a细胞活力明显下降,细胞凋亡率和miR-20a-5p表达明显升高〔细胞活力(A值):0.311±0.028比0.412±0.029,细胞凋亡率:(36.343±0.761)%比(31.802±0.647)%,miR-20a-5p(2^(-ΔΔCt)):32.348±0.348比8.912±0.183,均P<0.01〕;而I组N2a细胞活力明显升高,细胞凋亡率和miR-20a-5p表达明显下降〔细胞活力(A值):0.498±0.017比0.412±0.029,细胞凋亡率:(26.437±0.793)%比(31.802±0.647)%,miR-20a-5p(2^(-ΔΔCt)):6.875±0.219比8.912±0.183,均P<0.01〕。E组与NC组N2a细胞活力、细胞凋亡率和miR-20a-5p的表达比较差异均无统计学意义。结论M1-exo加重氧糖剥夺复氧后神经元的损伤,这一损伤作用可能与其携载的miR-20a-5p有关。

外泌体在M1型小胶质细胞诱发神经元损伤中的作用

目的评价外泌体在M1型小胶质细胞诱发神经元损伤中的作用。方法将生长良好的BV2小胶质细胞加入脂多糖100 ng/ml和干扰素-γ20 ng/ml诱导小胶质细胞极化为M1表型。收集M1型小胶质细胞上清液,提取外泌体。将生长良好的N2a细胞采用随机数字表法分为4组(n=24):对照组(C组)、M1型小胶质细胞组(M组)、外泌体组(E组)和外泌体抑制剂+M1型小胶质细胞组(G+M组)。C组常规培养24 h;M组加入M1型小胶质细胞上清液培养24 h;E组加入M1型小胶质细胞源性的外泌体培养24 h;G+M组于M1型小胶质细胞加入外泌体抑制剂GW4869培养24 h后,取上清液,加入到N2a细胞中培养24 h。采用CCK-8法检测N2a细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡率,qRT-PCR法检测Bcl-2和Bax的mRNA表达,Western blot法检测凋亡相关基因Bcl-2和Bax的表达。结果与C组比较,其余3组细胞活力降低,细胞凋亡率升高,Bcl-2及其mRNA表达下调,Bax及其mRNA表达上调(P<0.05);与M组比较,G+M组细胞活力升高,细胞凋亡率下降,Bcl-2及其mRNA表达上调,Bax及其mRNA表达下调(P<0.05),E组和M组上述指标差异无统计学意义(P>0.05)。结论M1型小胶质细胞可通过外泌体介导神经元损伤。

电刺激对LPS诱导M1型小胶质细胞活化的影响

目的评价电刺激对LPS诱导M1型小胶质细胞活化的影响。方法将生长良好的BV2小胶质细胞采用随机数字表法分为3组(n=18):对照组(C组)、LPS组和LPS+电刺激组(LE组)。C组常规培养24 h,LPS组和LE组加入浓度为100 ng/ml的LPS培养基孵育24 h,LE组于LPS孵育前给予100 mV/mm的直流电刺激4 h。采用ELISA法检测上清液TNF-α和IL-1β浓度;免疫荧光染色法检测M1型小胶质细胞表面标志物CD32和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达水平;qRT-PCR法检测细胞CD32和iNOS的mRNA表达水平。结果与C组相比,LPS组和LE组上清液TNF-α和IL-1β浓度升高,细胞CD32和iNOS及其mRNA表达上调(P<0.05);与LPS组相比,LE组上清液TNF-α和IL-1β浓度降低,细胞CD32和iNOS及其mRNA表达下调(P<0.05)。结论电刺激可抑制LPS诱导M1型小胶质细胞活化,从而减轻炎症反应。

hsa_circ_0025853在低温减轻神经母细胞瘤细胞氧糖剥夺-复糖复氧损伤中的作用

目的:评价hsa_circ_0025853在低温减轻神经母细胞瘤细胞(SK-N-SH细胞)氧糖剥夺-复糖复氧损伤中的作用。方法:体外培养SK-N-SH细胞至对数生长期,采用随机数字表法分为4组(n=20):对照组(C组)、氧糖剥夺-复糖复氧组(OGD/R组)、低温组(H组)、hsa_circ_0025853干扰RNA(siRNA)+低温组(S+H组)。C组细胞在正常条件下培养;OGD/R组氧糖剥夺3 h后复糖复氧24 h;H组氧糖剥夺3 h后,在32℃低温下复糖复氧24 h。S+H组在氧糖剥夺-复糖复氧模型制备前48 h转染siRNA序列,余同H组。于复糖复氧24 h时,采用CCK-8法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡率,qRT-PCR法检测线粒体动力相关蛋白1(Drp1)mRNA、hsa_circ_0025853表达,Western blot法检测Drp1表达水平。结果:与C组比较,其余3组细胞活力降低,细胞凋亡率升高,hsa_circ_0025853表达下调,Drp1及其mRNA表达上调(P<0.05);与OGD/R组比较,H组和S+H组细胞活力升高,细胞凋亡率降低,hsa_circ_0025853表达上调,Drp1及其mRNA表达下调(P<0.05)。与H组比较,S+H组细胞活力降低,细胞凋亡率升高,hsa_circ_0025853表达下调,Drp1及其mRNA表达上调(P<0.05)。结论:低温减轻SK-N-SH细胞氧糖剥夺-复糖复氧损伤的机制与上调hsa_circ_0025853的表达,从而降低Drp1水平有关。

miR-205-3p在氧糖剥夺-复氧复糖星形胶质细胞胀亡中的作用:与AQP4的关系

目的评价miR-205-3p在氧糖剥夺-复氧复糖(OGD/R)星形胶质细胞胀亡中的作用及其与水通道蛋白4(AQP4)的关系。方法体外培养原代星形胶质细胞至对数生长期,采用随机数字表法分为5组(n=16):对照组(C组)、OGD/R组(O组)、OGD/R+miR-205-3p模拟物组(M组)、OGD/R+miR-205-3p抑制剂组(I组)和OGD/R+阴性对照组(NC组)。C组在正常条件下培养,O组于37℃厌氧孵育箱(含94%N_(2)、1%O_(2)和5%CO_(2))氧糖剥夺4 h,于复氧复糖24 h;M组、I组和NC组分别转染miR-205-3p模拟物、抑制剂和阴性对照后,氧糖剥夺4 h,复氧复糖24 h。采用CCK-8法检测细胞活力,流式细胞术分析细胞损伤及胀亡情况,qRT-PCR法检测AQP4 mRNA表达,Western blot法检测AQP4及porimin的表达。结果与C组相比,O组miR-205-3p表达下调,细胞活力降低,细胞损伤率及胀亡率升高,AQP4及其mRNA和porimin表达上调(P<0.05);与O组相比,M组miR-205-3p表达上调,细胞活力升高,细胞损伤率及胀亡率降低,AQP4及其mRNA和porimin表达下调,I组miR-205-3p表达下调,细胞活力降低,I组细胞损伤率及胀亡率升高,AQP4及其mRNA和porimin表达上调(P<0.05),NC组差异无统计学意义(P>0.05)。结论miR-205-3p参与了OGD/R星形胶质细胞胀亡的过程,与调控AQP4表达有关。

miR-20a-5p在M1型小胶质细胞加重氧糖剥夺-复糖复氧神经元损伤中的作用:与MFN2的关系

目的评价miR-20a-5p在M1型小胶质细胞加重氧糖剥夺-复糖复氧(OGD/R)后神经元损伤中的作用及其与线粒体融合蛋白2(MFN2)的关系。方法将生长良好的BV2小胶质细胞(M0型)用脂多糖(100 ng/ml)和干扰素-γ(20 ng/ml)诱导小胶质细胞极化为M1表型,并通过qRT-PCR和免疫荧光法进行鉴定。将生长良好的N2a细胞采用随机数字表法分为6组(n=6):对照组(C组)、OGD/R组(OGD/R组)、M0型小胶质细胞共培养组(M0组)、M1型小胶质细胞共培养组(M1组)、转染miR-20a-5p抑制剂组(I组)和阴性对照组(NC组)。C组细胞常规培养;OGD/R组氧糖剥夺3 h,复糖复氧24 h制备N2a细胞氧糖剥夺-复糖复氧损伤模型;M0组氧糖剥夺3 h,复糖复氧时与M0型小胶质细胞共培养24 h;M1组氧糖剥夺3 h后复糖复氧时与M1型小胶质细胞共培养24 h;I组和NC组分别将转染试剂miR-20a-5p抑制剂和阴性对照miRNA转染至M1型小胶质细胞后,将N2a细胞氧糖剥夺3 h,复糖复氧时与转染后的M1型小胶质细胞共培养24 h。采用CCK-8法测定细胞活力,测定乳酸脱氢酶(LDH)漏出量,采用qRT-PCR法检测miR-20a-5p和MFN2 mRNA的表达,采用Western blot法检测MFN2表达。结果与C组比较,其余5组细胞活力降低,LDH漏出量增加,MFN2及其mRNA表达下调,OGD/R组、M0组和M1组miR-20a-5p表达上调,I组miR-20a-5p表达下调(P<0.05);OGD/R组与M0组细胞活力、LDH漏出量、miR-20a-5p、MFN2及其mRNA表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。与OGD/R组和M0组比较,M1组细胞活力下降,LDH漏出量增加,MFN2及其mRNA表达下调,miR-20a-5p表达上调(P<0.05);与M1组比较,I组细胞活力增加,LDH漏出量下降,MFN2及其mRNA表达上调,miR-20a-5p表达下调(P<0.05)。结论M1型小胶质细胞加重N2a细胞OGD/R损伤的机制可能与M1型小胶质细胞miR-20a-5p表达上调抑制N2a细胞MFN2表达有关。

外泌体在M2型小胶质细胞减轻星形胶质细胞氧糖剥夺-复糖复氧损伤中的作用

目的评价外泌体在M2型小胶质细胞减轻星形胶质细胞氧糖剥夺-复糖复氧损伤中的作用。方法体外培养原代星形胶质细胞至对数生长期,采用随机数字表法分为5组(n=14):对照组(C组)、氧糖剥夺-复糖复氧组(O组)、氧糖剥夺-复糖复氧+M2型小胶质细胞组(O+M2组)、氧糖剥夺-复糖复氧+M2型小胶质细胞+GW4869组(O+M2+G组)和氧糖剥夺-复糖复氧+M2型小胶质细胞源性外泌体组(O+M2-E组)。C组在正常条件下培养,O组氧糖剥夺4 h,复糖复氧24 h;O+M2组氧糖剥夺4 h,复糖复氧时加入M2型小胶质细胞的上清液2 ml培养24 h;O+M2+G组氧糖剥夺4 h,复糖复氧时加入经外泌体抑制剂GW486910μmol/L处理后的M2型小胶质细胞上清液2 ml培养24 h;O+M2-E组氧糖剥夺4 h,复糖复氧时加入M2型小胶质细胞源性外泌体10μg/ml培养24 h。光镜下观察细胞形态变化,采用CCK-8法检测细胞活力,qRT-PCR法检测水通道蛋白4(AQP4)mRNA表达水平,Western blot法检测AQP4及胀亡蛋白porimin的表达水平。结果与C组相比,其余4组细胞活力下降,AQP4及其mRNA、porimin表达上调(P<0.05),细胞发生水肿;与O组相比,O+M2组和O+M2-E组细胞活力升高、AQP4及其mRNA和porimin表达下调,O+M2+G组上述指标差异无统计学意义(P>0.05),细胞水肿程度减轻;与O+M2组相比,O+M2+G组细胞活力下降,AQP4及其mRNA和porimin表达上调(P<0.05),O+M2-E组上述指标差异无统计学意义(P>0.05),细胞水肿程度增强。结论M2型小胶质细胞可通过外泌体减轻星形胶质细胞氧糖剥夺-复糖复氧损伤。