淋病奈瑟菌WHO-A株头孢曲松耐药相关sRNA筛选

对淋病奈瑟菌WHO-A株进行转录组测序以获取其非编码RNA(sRNA)的信息,通过梯度剂量诱导淋病奈瑟菌头孢曲松耐药株,生物信息学方法筛选并荧光定量PCR验证以研究头孢曲松耐药调控相关sRNA。结果表明:经诱导WHO-A株产生MIC为1μg·mL-1的耐药变异株,野生型WHO-A株存在1 051条sRNA,其中80条与penA、porB、mtrR等8个耐药相关基因间存在互补关系,检测发现10条表达水平随耐药性增高而降低的sRNA,说明部分sRNA参与淋病奈瑟菌头孢曲松耐药性调控。

CRISPR系统中Cas蛋白的分类及作用机制

CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)系统存在于40%细菌与90%古细菌中,由前导序列、回文重复序列、相关Cas蛋白三部分构成。Cas蛋白是CRISPR系统中的一类核酸酶,对CRISPR系统发挥获得性免疫功能具有重要作用。已鉴定出至少45个Cas蛋白家族,其多样性对现有分类系统提出了巨大挑战。不同类型的Cas蛋白在CRISPR系统适应、表达、干扰等作用阶段发挥的功能各异。本文主要讨论Cas蛋白的分类及作用机制的研究进展。

淋病奈瑟菌WHO-A株Cas蛋白的表达和多克隆抗体制备

为研究淋病奈瑟菌CRISPR系统中Cas蛋白的结构与功能,以WHO-A株基因组DNA为模板,利用PCR技术克隆出CT和TM 2个Cas基因,在大肠埃希菌中进行原核表达。分别用pCold-TF表达的CT和TM重组蛋白免疫小鼠制备Cas抗体;以pGEX-6p-1表达的CT和TM重组蛋白为检测抗原测定免疫血清中特异性抗体的效价。结果表明:获得了与预期分子量大小一致的重组抗原,间接ELISA检测表明,小鼠免疫血清中CT和TM抗体的效价分别为1∶25 600、1∶12 800。结果说明为细胞外探索淋病奈瑟菌中Cas蛋白的作用机制和细胞内检测相关蛋白的含量提供了试验材料。

利用CRISPR／Cas9系统抑制Kan耐药基因水平转移研究

目的研究细菌耐药基因水平转移的控制技术。方法以卡那霉素耐药基因Kan为靶基因设计3组靶向sgRNA．分别退火后插入到pCas9质粒中，重组菌用氯化钙法制成感受态，将含有Kan耐药基因的质粒pET-30a向其转化，转化菌液分别涂布含氯霉素和含氯霉素／卡那霉素平板，比较各组转化效率。将携带Kan特异性sgRNA的重组质粒分别转化含pET-30a的大肠埃希菌，PCR检测Kan耐药基因的降解．并绘制转化子在氯霉素平板上的生长曲线以分析特异性sgRNA对受体菌生长的影响。结果所设计的3组sgRNA中有2组可以介导CRISPR／Cas9系统对Kan耐药基因水平转移的完全抑制．其余1组也可使转移效率降低88．08％。抑制机制为特异性CRISPR／Cas9系统降解了Kan耐药基因。未发现3组sgRNA对受体菌生长有明显影响。结论特异性CRISPR／Cas9系统可抑制细菌Kan耐药基因的水平转移。