离体细胞的非放射性原位杂交

离体细胞的非放射性原位杂交单惠敏，黄曼影，王悦，周远征，许荣 （中国医学科学院基础医学研究所，北京１００００５）早在１９６９年，人们就开始把分子杂交技术应用到组织切片和细胞标本上￣［１～３］。现在，虽然在探针标记上大致可把原位杂交分为同位素标记和非同...

褪黑素抑制促甲状腺释放激素刺激乳鼠垂体前叶细胞催乳素基因的表达

褪黑素（melatonin，MEL）主要由松果腺分泌，它是一种吲哚类激素，其功能之一能抑制下丘脑的促性腺释放激素和垂体前叶的促性腺激素。本工作利用原位杂交方法，观察了MEL对促甲状腺释放激素（thyrotropinreleasinghormone，TRH）兴奋垂体前叶激素-催乳素（prolactin，PRL）表达的影响。结果表明，在一定浓度范围内，MEL不但可抑制TRH刺激PRL基因表达的效应，还可直接抑制垂体前叶细胞PRL基因的表达。这为进一步探讨在体条件下MEL对PRL合成与分泌的调节，提供了实验依据。

高脂饮食诱发血糖升高的动物模型中瘦素与胰岛素变化的关系

高脂饲料喂养大鼠 ,诱发胰岛素抵抗形成血糖升高 ,以研究瘦素与糖尿病的关系。将大鼠分为正常和高脂饲料喂养组 ,于喂养前及喂养 30、6 0d时测血糖、瘦素与胰岛素水平 ,行高胰岛素正常血糖钳夹试验 ,最后分离脂肪称重。结果 :高脂饮食组具有明显的胰岛素抵抗 ,有 5 0 %血糖升至 8 3mmol L以上 ;形成糖尿病的大鼠体重与对照组无明显区别 ;高脂饮食组瘦素与胰岛素水平与对照组比较有明显差异 ;所有大鼠瘦素水平与体重、胰岛素、血糖均呈正相关。结论 :(1)高脂饮食是导致胰岛素抵抗形成糖尿病的诱因之一 ;(2 )体脂含量与糖尿病正相关 ;(3)瘦素抵抗与胰岛素抵抗形成糖尿病的发病机制可能有关 ;(4)瘦素水平随着鼠龄的增加而增高 。

异体垂体移植大鼠E_2诱致催乳素瘤的实验研究

目的 探讨催乳素瘤的发病机理,验证其原发于腺垂体的假说。方法 应用雄性S.D.大鼠进行异体垂体移植,并通过背部埋植17-β-雌二醇(E_2)药泵,观察E_2对大鼠原位垂体,异体移植于肾囊的垂体及血浆催乳素(prolactin,PRL)水平的影响。并利用上述垂体细胞原代培养及原位杂交组化方法,研究经E_2作用120d后的原位及移植垂体细胞中PRL基因表达水平的改变。结果 经E_2作用60d及120d后,大鼠体重分别降至正常大鼠的74%(P<0.01)和50%(P<0.001),原位垂体及移植垂体的重量则较对照组增加达三倍以上(P<0.001),并伴高催乳素血症,血浆催乳素水平为对照组的100～200倍(P<0.001)。原位杂交结果表明,E_2作用120d后,原位及移植垂体细胞中PRL mRNA水平分别升高为正常大鼠垂体细胞的3.1倍和3.5倍(P<0.001),且二者的表达水平无显著差异。结论 提示E_2也可不经下丘脑机制直接作用于腺垂体水平诱发催乳素瘤,即催乳素瘤有可能原发于腺垂体。但本工作尚未进一步排除催乳素瘤的形成涉及下丘脑机制的可能性。

17-β-雌二醇诱发大鼠腺垂体催乳素瘤的形成及原癌基因c-myc的高表达

给SD大鼠皮下埋植17-β-雌二醇,60天后,其垂体重量显著增加;垂体前叶细胞明显增生,分化受抑制;用放射免疫法测定血浆催乳素含量显著增加;斑点杂交显示垂体细胞原癌基因c-myc的转录水平也显著增加。

生长因子和雌激素对大鼠垂体前叶细胞增殖活性及催乳素基因表达的影响

目的观察外源性生长因子和雌激素对离体正常大鼠垂体前叶细胞增殖活性及催乳素（ｐｒｏｌａｃｔｉｎ，ＰＲＬ）基因表达的影响，并探讨生长因子与雌激素作用的关系。方法应用无血清原代培养的大鼠垂体前叶细胞，分别采用荧光染色细胞ＤＮＡ的激光扫描共聚焦显微镜（ｌａｓｅｒｓｃａｎｎｉｎｇｃｏｎｆｏｃａｌｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ＬＳＣＭ）扫描、以及原位杂交方法，观察１７－β－雌二醇（ｅｓｔｒａｄｉｏｌ，Ｅ２）、表皮生长因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈ ｆａｃ－ｔｏｒ，ＥＧＦ）及转化生长因子β１（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒβ１，ＴＧＦβ１）对大鼠垂体前叶细胞增殖活性和催乳素（ｐｒｏｌａｃｔｉｎ，ＰＲＬ）基因表达的影响。结果生长因子或雌激素作用３６ｈ后，Ｅ２和ＥＧＦ单独作用组细胞ＤＮＡ含量和ＰＲＬｍＲＮＡ含量均较正常对照组明显升高（Ｐ＜０．００１）；两者共同作用上述效应更为显著，高于Ｅ２和ＥＧＦ单独作用组（Ｐ＜０．０１）。ＴＧＦβ１对细胞增殖与ＰＲＬ基因表达均有抑制作用（Ｐ＜０．００１）；而与Ｅ２共同作用时细胞内ＤＮＡ含量和ＰＲＬｍＲＮＡ水平显著高于ＴＧＦβ１单独作用组（Ｐ＜０．００１），但仍低于Ｅ２单独作?

雌二醇诱致大鼠垂体催乳素瘤形成过程催乳素基因DNase Ⅰ敏感位点增加

ＤＨａｓｅⅠ敏感位点的存在，是染色质水平上基因活化调节的重要基础之一。为探讨Ｅ２诱发垂体ＰＲＬ瘤形成的表基因机制，本工作观察了Ｅ２诱致的垂体催乳素瘤催乳素基因ＤＮａｓｅⅠ敏感位点的改变。结果表明：Ｅ２诱致大鼠垂体前叶ＰＲＬ瘤细胞ＰＲＬ基因的ＤＮａｓｅⅠ敏感位点较正常大鼠增多，提示在Ｅ２诱发ＰＲＬ瘤形成过程中，ＰＲＬ基因处于活化状态。

雌二醇诱致大鼠垂体催乳素瘤细胞中催乳素基因第1、2、4外显子的低甲基化

本工作探讨了雌二醇（Ｅ２）诱致的雄性ＳＤ（Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ）大鼠垂体催乳素（ｐｒｏ－ｌａｃｔｉｎ，ＰＲＬ）瘤中ＰＲＬ基因含ＣＣＧＧ位点的第１、２、４外显子中ＣＣＧＧ位点甲基化状态的改变。提取基因组ＤＮＡ并分别用对非甲基化ＣＣＧＧ位点不敏感而对甲基化ＣＣＧＧ敏感的ＨｐａⅡ及对甲基化和非甲基化ＣＣＧＧ位点均不敏感的ＭｓｐⅠ进行完全消化后，利用聚合酶链反应（Ｐｏｌｙｍｅｒｓａｓｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）方法，对含有ＣＣＧＧ位点的ＰＲＬ基因第１、第２和第４外显子的部分序列进行扩增。结果：用ＨｐａⅡ消化后，正常大鼠基因组ＤＮＡ用三对不同引物经ＰＣＲ扩增，均得到预期的含ＣＣＧＧ位点的特异片段（分别为１６３９ｂｐ、２６８ｂｐ和１３３ｂｐ），而Ｅ２致瘤组则均未能扩增出相应的片段，提示正常大鼠ＰＲＬ基因第１、２、４外显子ＣＣＧＧ位点均成甲基化状态，而Ｅ２致瘤后，则均成非甲基化状态。不管是正常对照组，还是Ｅ２致瘤组，经ＭｓｐⅠ消化后，均未能扩增出预期的ＰＲＬ基因片段，而未经ＭｓｐⅠ、ＨｐａⅡ消化组，均扩增出了预期的片段。以上结果表明，Ｅ２所致的大鼠垂体ＰＲＬ瘤，其ＰＲＬ基因外显子中的ＣＣＧＧ位点均呈低甲基?

褪黑素抑制雌二醇诱致的垂体PRL瘤生长与血浆PRL和过氧化脂质含量的关系

雄性Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ大鼠皮下埋置１７－β雌二醇（１７－β－ｅｓｔｒａｄｉｏｌ，Ｅ２）药泵诱发垂体催乳素（ｐｒｏｌａｃｔｉｎ，ＰＲＬ）瘤，并每日皮下注射褪黑素（ｍｅｌａｔｏｎｉｎ，ＭＬＴ），观察ＭＬＴ对Ｅ２诱发ＰＲＬ瘤生长的影响。另外，采用放免法和紫外分光光度法测定大鼠血浆ＰＲＬ和过氧化脂质（ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｌｉｐｉｄ，ＰＬ）浓度，观察ＰＲＬ瘤重量与大鼠血浆 ＰＲＬ、ＰＬ浓度间的相关关系。实验结果显示，在对照组、０．０５、０．２５、０．５０、１．００和 ２．００ｍｇ ＭＬＴ组，ＰＲＬ瘤重量分别为１１５．０±７１．０、８５．２±４１．０、５８．９±２４．１、７２．７±２３．６、７９．３±５６．１、７４．５±４６．８ｍｇ；血浆ＰＲＬ浓度分别为４９３．４６±３３．３、３７３．７８±２６．５、１２５．１３±１３．３、２０１．７９±１１．２、４１８．８８±４１．３、２８１．９４±３６．４ｎｇ／ｍｌ；血浆ＰＬ水平分别为１．２１±０．２３、０．８９±０．３２、０．９２±０．２７、０．６４±０．２４、０．４１±０．１４、０．４３±０．２１△Ｄ２３３／ｍｌ。相关性分析表明，ＰＲＬ瘤重量与血浆 ＰＲＬ浓度间的相?

褪黑素抑制由 17-β-雌二醇诱发的垂体催乳素瘤的生长

观察整体条件下褪黑素 (melatonin, MLT)抑制由 17-β-雌二醇 (E2)诱发的垂体催乳素 (prolactin, PRL)瘤的生长，并初步探讨其作用机制。方法以雄性 Sprague- Dawley大鼠皮下埋植 E2药泵，诱发 PRL瘤。实验组大鼠分 5组，在诱瘤之前每日定时分别皮下注射 0.05、 0.25、 0.50、 1.00和 2.00 mg MLT，共 90 d;对照组大鼠皮下注射等体积 4％乙醇－生理盐水。结果 (1)给予 0.05、 0.25、 0.50、 1.00和 2.00 mg MLT处理组 PRL瘤重量分别较对照组降低 25.91％ (P >0.05)、 48.78％ (P< 0.01)、 36.78％ (P< 0.05)、 31.04％ (P >0.05)和 35.22％ (P > 0.05); (2)Northern Blot分析表明，注射 0.05、 0.25、 0.50 mg MLT组 PRL瘤细胞 PRL mRNA表达水平分别比对照组降低 33.67％ (P< 0.05)、 25.51％ (P< 0.05)和 41.84％ (P< 0.01)；原代培养的 PRL瘤细胞原位杂交实验也获得类似结果 ; (3)激光扫描共聚焦显微镜检测结果显示， 0.05、 0.25和 0.50 mg MLT组 PRL瘤细胞 DNA的相对含量分别较对照组降低 40.73％ (P< 0.001)、 51.15％ (P< 0.001)和 60.23％ (P< 0.001); (4)紫外分光光度法测定显示， 0.05、 0.25、 0.50、 1.00和 2.00 mg MLT组血浆过氧化脂质水平分别比对照组降低 26.45％ (P< 0.05)、 23.97％ (

甘丙肽（galanin）对大鼠垂体前叶催乳素和β－内啡肽释放的调节

本工作探讨甘丙肽是否参与垂体前叶催乳素和β－内啡肽释放的调节。实验分两部分：（１）在体实验，给清醒自由活动的大鼠第三脑室内微量注射甘丙肽（１μｇ或３μｇ／只），用放射免疫测定法检测血浆催乳素和β－内啡肽的浓度。结果如下：每只大鼠给１μｇ或３μｇ的甘丙肽后，都显著兴奋催乳素的静息分泌，３μｇ甘丙肽对催乳素分泌的兴奋效应显著大于１μｇ的作用。两种剂量的甘丙肽都不影响限制性应激引起的催乳素的释放；对β－内啡肽的静息分泌和应激引起的释放也无明显影响。（２）离体实验，在体外培养的垂体前叶细胞中，加入不同剂量的甘丙肽（０．０５，０．５和１．０μｇ），孵育１ｈ后，用上述方法测定培养液中催乳素和β－内啡肽的浓度。其结果是三种剂量的甘丙肽都显著兴奋β－内啡肽的分泌，兴奋效应随甘丙肽的剂量增加而增大，有显著的剂量效应；但三种剂量的甘丙肽对催乳素的分泌均无作用。以上结果表明，甘丙肽对垂体前叶催乳素和β－内啡肽释放的调节作用不同。中枢的甘丙肽可能通过一定的下丘脑机制兴奋垂体前叶催乳素的静息分泌，但不影响应激引起的催乳素的释放，也不影响β－内啡肽的静息分泌和应激引起的释放。外周的甘丙肽虽然对垂体前叶细胞的催乳素分泌无直接作用，但兴奋?

血管活性肠肽和组异肽对催乳素基因转录调控作用的比较

实验用ＳＤ大鼠垂体前叶细胞原代培养及原位杂交方法，研究不同浓度的血管活性肠肽（Ｖａ－ｓｏａｃｔｉｖｅＩｎｔｅｓｔｉｎａｌＰｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ，ＶＩＰ）或组异肽（ＰｅｐｔｉｄｅＨｉｓｔｉｄｉｎｅＩｓｏｌｅｕｃｉｎｅ，ＰＨＩ）对催乳素（Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ，ＰＲＬ）基因转录水平的调节。结果表明，经不同浓度的ＶＩＰ或ＰＨＩ与垂体前叶细胞一起孵育２４ｈ后，胞内ＰＲＬｍＲＮＡ随ＶＩＰ及ＰＨＩ浓度的加大而升高（Ｐ＜０．０１）。１０￣（－８）、１０￣（－７）、１０￣（－６）ｍｏｌ／Ｌ的ＶＩＰ分别使胞内ＰＲＬｍＲＮＡ升高为对照组的３．０、４．０、４．７倍；１０￣（－９）、１０￣（－８）、１０￣（－７）ｍｏｌ／Ｌ的ＰＨＩ则分别使细胞内ＰＲＬｍＲＮＡ升高为对照组的２．５、３．８、５．５倍。进一步分析表明，虽然ＶＩＰ及ＰＨＩ均促进ＰＲＬ基因转录，但它们的作用强度不同。１０￣（－８）、１０￣（－７）ｍｌｏ／Ｌ的ＰＨＩ分别使细胞内ＰＲＬｍＲＮＡ的含量升高为相同浓度ＶＩＰ的１．５倍及１．６倍（Ｐ＜０．０５），提示ＰＨＩ促进ＰＲＬ基因转录的作用比ＶＩＰ强。

血管紧张素Ⅱ调节雄性大鼠催乳素和β-内啡肽的释放

本工作给清醒、自由活动的SD雄性大鼠第三脑室内注射血管紧张素Ⅱ,用放射免疫测定给药前后血浆催乳素(PRL)和β-内啡肽(β-EP)含量的变化,结果显示,注射ANGⅡ50和500ng,可显著升高血浆PRL和β-EP的含量。静脉注射多巴胺受体阻断剂spiroperidol后,也可显著升高血浆PRL水平,若在此基础上加脑室内注射50ng ANGⅡ,血浆PRL含量与单独静脉注射spiroperidol无显著差别。在体外,ANGⅡ作用于前叶垂体细胞后,可使其培养液中PRL和β-EP含量显著升高。用EGTA络合细胞外Ca^(2+)后,不影响10^(-8)M ANGⅡ所致的PRL升高,但部分抑制其升高β-EP的效应。10^(-8)M的ANGⅡ可使垂体细胞内Ca^(2+)浓度显著升高,但不影响其胞内cAMP的含量。

WS-频谱治疗仪照射对大鼠癫痫模型软脑膜微循环血流量的影响及其治疗作用

远红外频谱治疗仪照射注射士的宁引起的大鼠癫痫模型大椎穴前后 ,观察用激光微循环血流计测量的软脑膜局部微循环血流量及癫痫症状的变化 ,发现模型大鼠 +频谱治疗后软脑膜微血流量明显增加 (P<0 0 5～ 0 0 1) ,癫痫症状改善 ,发作时间推迟 ,抽搐次数减少及每次抽搐持续时间缩短 ,甚至有的不发生癫痫。频谱仪照射减轻大鼠癫痫症状 。

GRP和VIP对E_2诱致的垂体催乳素(PRL)瘤细胞PRL基因转录的影响

实验应用雄性SD大鼠，皮下埋植内置10mg雌二醇（E2）硅胶管3个月致垂体催乳素（prolactin，PRL）瘤后，取PRL瘤细胞进行体外原代培养，并应用原位杂交方法，研究不同剂量的胃泌素释放肽（gastrin－releasingpeptide，GRP）和血管活性肠肽（vasoactiveintestinalpolypeptide，VIP）以及E2对离体培养的垂体PRL瘤细胞PRL基因转录的影响。结果如下：GRP，VIP分别与PRL瘤细胞孵育24h后，10－8mol／L，10－7mol／L的GRP均不影响PRL瘤细胞内PRLmRNA水平，但10-6mol／L的GRP可使胞内PRLmRNA水平下降20％（P＜0．05）。在本实验所采用的浓度范围内，VIP均可升高PRL瘤细胞内PRLmRNA水平，10－8mol／L，10－7mol／L，10－6mol／L的VIP分别使胞内PRLmRNA升高为对照组的1．60，2．10，2．21倍（P＜0．05）。三种浓度的E2分别与PRL瘤细胞孵育48h后，10－8mol／LE2不影响胞内PRLmRNA水平，但10－7mol／L，10－6mol／L的E2则分别可使胞内PRLmRNA升高为对照组的2．80，2．92倍（P＜0．05）。上述结果表明：GRP和VIP可能分别抑制和增强由E2诱致的垂体PRL瘤细胞PRL基因的转录；一定浓度的E2可能直接涉及E2诱发垂体PRL瘤时伴高PRL血症。

褪黑激素对17-β-雌二醇诱致的大鼠垂体催乳素瘤细胞增殖的抑制作用

观察不同浓度的褪黑激素 (Melatonin ,MLT)对原代培养的大鼠垂体催乳素瘤细胞增殖的影响。用 80～10 0g体重的雄性Sprague Dawley(SD)大鼠 ,皮下埋置雌二醇诱致垂体催乳素瘤 (prolactinoma)形成后 ,取出瘤体 ,经消化、过滤、离心 ,用SFFD培养基重悬细胞 ,得细胞悬液 ,浓度为 0 75× 10 6/mL ,转入 2 4孔培养板中并加入相应剂量的MLT使其终浓度 (mol/L)分别为 10 -5、10 -7、10 -9、10 -11和 10 -13 ,另设空白对照组 ,于 37℃、5 %CO2 条件下培养 1h ,再在每孔中加入 2 μCi [3H] TdR继续孵育 2 4h后测counts/min值。结果显示 ,在对照组和各剂量 (mol/L)MLT用药组 10 -5,10 -7,10 -9,10 -11和 10 -13 的 [3H]-TdR掺入率分别为 2 0 38 75± 186 84,142 1 75±6 4 49,12 38 2 5± 6 1 72 ,92 4 0 0± 6 4 44 ,10 33 2 5± 12 7 2 2和 110 3 2 5± 15 1 5 3counts/min。表明 10 -5～10 -13mol/L的MLT能有效抑制 [3H] TdR在原代培养的垂体催乳素瘤细胞中的掺入 ,P <0 0 0 1。其中 ,以 10 -9mol/L的MLT的抑制作用最强 ,达 5 4 6 8%。提示在培养条件下 ,10 -5～ 10 -13 mol/LMLT能有效地抑制E2 诱导的垂体催乳素瘤细胞的增殖。

17-β-雌二醇对大鼠垂本前叶细胞转化生长因子基因表达的影响

实验采用无血清原代培养大鼠垂体前叶细胞及原位杂交方法，观察了不同剂量（１０１０、１０８和１０６ｍｏｌ／Ｌ）的１７β雌二醇（ｅｓｔｒａｄｉｏｌ，Ｅ２）对大鼠垂体前叶细胞转化生长因子α（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒα，ＴＧＦα）和转化生长因子β１（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒβ１，ＴＧＦβ１）基因表达的影响。结果表明：１０１０ｍｏｌ／ＬＥ２作用２４ｈ后，对两种生长因子的表达均无显著影响；而１０８ｍｏｌ／Ｌ和１０６ｍｏｌ／ＬＥ２则显著升高ＴＧＦαｍＲＮＡ，分别为对照组的１５倍和１６倍（ｐ＜０００１）；同时明显降低ＴＧＦβ１ｍＲＮＡ，使ＴＧＦβ１ｍＲＮＡ水平分别降低为对照组的７０％和５５％（ｐ＜０００１）。说明一定浓度的Ｅ２对正常大鼠垂体前叶细胞ＴＧＦα和ＴＧＦβ１基因表达有明显影响，提示这两种生长因子可能以自分泌／旁分泌机制。

甘丙肽（GAL）和胆囊收缩素（CCK）对垂体前叶催乳素和β－内啡肽释放的影响

甘丙肽（ＧＡＬ）和胆囊收缩素（ＣＣＫ）对垂体前叶催乳素和β－内啡肽释放的影响许荣 ，周远征，黄曼影，单惠敏，郭传海（中国医学科学院基础医学研究所生理研究室北京１００００５）本工作通过在体（ｉｎｖｉｖｏ）和离体（ｉｎｖｉｔｒｏ）实验，探讨甘丙肽（ｇａｌ?..

雌二醇对大鼠垂体前叶细胞增殖的影响及其机制的初步探讨

观察了17-β羟雌二醇（17-β-estradiol，E2）及其代谢产物2-羟雌酮（2-hydroxyestrone，2－OHE1）、2-羟雌二醇（2－hydroxyestradiol，2－OHE2）和多巴胺（dopamine，DA）受体激动剂piribedil对大鼠垂体前叶细胞（aneriorpituitarycells，APC）增殖的影响。结果表明：E2（10－6mol/L）可促进APC生长，A10－5mol/L的piribedil却可抑制APC的增殖活性。提前12h加入E2或2－OHE2、2－OHE2可抑制piribedil的效应，但E2对piribedil效应无明显影响。

胆囊收缩素对大鼠催乳素释放的调节及其机理

给清醒自由活动的大鼠第三脑室内微量注射０．０５和０．５μｇ胆囊收缩素（ＣＣＫ－８）观察到，可显著兴奋前叶垂体催乳素（ＰＲＬ）的静息分泌，并进一步促进限制性应激引起的ＰＲＬ释放。０．０５μｇＣＣＫ－８的上述两种作用较０．５μｇＣＣＫ－８的效应更强。在体外培养的前叶垂体细胞中，分别加入０．０５、０．５、１．０μｇＣＣＫ－８，孵育１ｈ，看到３种剂量的ＣＣＫ－８均显著兴奋ＰＲＬ释放，兴奋效应依ＣＣＫ－８的剂量增加而增大；２×１０－４ｍｏｌ／ＬＣＣＫ－８可使前叶垂体细胞的胞内Ｃａ２＋浓度显著升高，而１０－６～１０－８ｍｏｌ／Ｌ的ＣＣＫ－８不影响其胞内ｃＡＭＰ的含量。