鸡毒支原体P31蛋白原核表达及膜定位鉴定

为筛选鸡毒支原体(MG)膜蛋白,利用生物信息学软件对其进行序列分析后,选择不含跨膜区的714 bp基因片段作为靶标蛋白进行原核表达(因其分子量约31 kDa,故而命名为P31蛋白),表达P31蛋白并进行纯化后制备兔多克隆抗体,运用ELISA方法检测抗体效价,提取MG液体培养物总蛋白、胞浆蛋白、膜蛋白,利用Western blot进行亚细胞定位。结果显示,P31蛋白具有跨膜结构和良好的B细胞抗原表位,原核表达后获取融合蛋白rP31,大小约为31 kDa,ELISA检测兔血清效价为1∶25600,Western blot分析显示,rP31蛋白分布在MG膜表面。本研究证实了P31蛋白确为MG膜蛋白且抗原性良好,可做为研发MG新型诊断方法、基因工程疫苗及治疗药物的候选蛋白。

猪流行性腹泻病毒贵州流行株N基因的克隆、测序与生物信息学分析

为了了解贵州省猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)的流行情况,试验对猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)贵州流行株(GZ2022)N基因序列进行克隆、测序,并利用DNAStar、ProtParam、ProtScale等生物信息学分析软件对PEDV-GZ2022株N基因的同源性和遗传进化地位,以及N蛋白的分子特征和潜在功能进行分析预测。结果表明:PEDV-GZ2022株N基因大小约为1364 bp,编码441个氨基酸;PEDV-GZ2022株N基因核苷酸序列与GenBank中的PEDV参考毒株N基因的相似性为95.5%~99.8%,与PEDV经典毒株CV777 N基因核苷酸序列的相似性为95.6%,与SDLY2020毒株N基因核苷酸序列的相似性高达99.8%,PEDV-GZ2022毒株与经典毒株CV777关系相隔较远,与PEDV变异株GⅡ-b位于同一分支;PEDV-GZ2022株N蛋白中含有较多的疏水性氨基酸,为疏水性蛋白;该蛋白质存在4个N糖基化位点和37个O糖基化位点,有31个丝氨酸、14个苏氨酸及3个酪氨酸可能被磷酸化,并且抗原指数较好。说明PEDV-GZ2022株为GⅡ-b变异株,PEDV-GZ2022 N蛋白可能具有良好的抗原性,可以作为潜在的诊断抗原。

PEDV结构蛋白颉颃IFN-Ⅰ应答的分子机制研究进展

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)具有很高的发病率和死亡率,尤其是在猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)高致病性变异株(GⅡ型毒株)出现以来,更是对全球养猪业构成了巨大威胁。病毒感染宿主之后,宿主会激活抗病毒天然免疫应答机制。干扰素(interferon,IFN)作为一类抵御病毒感染的关键分子,特别是Ⅰ型干扰素(IFN-Ⅰ)可通过激活各种免疫细胞和共刺激分子来颉颃病毒的增殖。与此同时,为实现在宿主内的持续复制,许多病毒建立了颉颃宿主机体IFN-Ⅰ应答的多种分子机制,进而实现免疫逃逸。PEDV编码的多种结构蛋白可以颉颃宿主IFN-Ⅰ免疫应答。文章综述了PEDV结构蛋白颉颃IFN-Ⅰ免疫应答的分子机制,以期为深入阐释PEDV免疫逃逸的分子机制与开发PEDV新型靶向药物和建立防控新策略提供科学参考。

E.coli HPI通过NLRP3/caspase-1信号通路诱导细胞焦亡而促进肠道炎症

目的:探究大肠埃希菌(Escherichia coli,E.coli)强毒力岛(high-pathogenicity island,HPI)对细胞焦亡及肠道炎症的影响。方法:用含HPI的E.coli株(HPI+)、HPI缺失的E.coli株(△HPI)和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)分别处理昆明小鼠和IPEC-J2细胞(猪小肠上皮细胞)。测定小鼠肠道乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性、IgA表达和分泌性IgA(secretory IgA,SIgA)含量;HE和TUNEL染色观察肠道损伤;RT-qPCR、免疫组织化学染色和Western blot检测小鼠肠组织和IPEC-J2细胞中核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)/caspase-1信号通路关键调控点的表达;ELISA检测小鼠血清和IPEC-J2细胞培养上清液中白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)和IL-18含量;共聚焦显微镜观察NLRP3与caspase-1的共定位。siRNA沉默IPEC-J2细胞的NLRP3,验证NLRP3在E.coli HPI感染中的关键调控功能。结果:相对于△HPI感染,E.coli HPI显著降低小鼠肠道SOD活性,增加IgA+B细胞,并促进LDH的释放和SIgA的分泌;ELISA、HE染色和TUNEL染色结果显示,E.coli HPI促进了小鼠肠道上皮细胞DNA断裂、组织损伤和炎症;Western blot结果显示,相对于△HPI,E.coli HPI感染使得小鼠肠道消皮素D的N端片段(gasdermin D N-terminal fragment,GSDMD-N)蛋白水平显著升高;RT-qPCR和免疫组织化学染色结果显示,E.coli HPI显著促进了小鼠肠道和IPEC-J2细胞中NLRP3、含caspase募集结构域的凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain,ASC)、caspase-1、GSDMD、IL-1β和IL-18的mRNA和蛋白表达,IL-1β和IL-18分泌增加;共聚焦显微镜观察发现,相对于△HPI感染,E.coli HPI显著促进了NLRP3炎症小体的组装,使得NLRP3与caspase-1发生共定位;此外,在NLRP3沉默的IPEC-J2细胞中观察到E.coli HPI诱导的细胞炎症、细胞损伤及NLRP3/caspase-1信号通路的激活被缓解。结论:HPI的存在增强了E.coli的毒力水平,促进肠道炎症;NLRP3/caspase-1信号通路调控的细胞焦亡参与了E.coli HPI诱导的肠道损伤。

黄芩苷对自噬介导H6N6禽流感病毒致病损伤的作用

探究黄芩苷对H6N6亚型禽流感病毒诱导小鼠肺脏致病损伤的作用。选用40只昆明小鼠随机分为4组,即对照组、模型组、黄芩苷治疗组、3-MA抑制剂组。通过HE染色观察肺组织病理形态学变化,ELISA法检测血清中IL-1β、IL-2、IL-6及TNF-α的含量,透射电镜检测小鼠肺脏中自噬体的水平,Western blot检测肺组织LC3、Beclin-1及ATG7蛋白表达水平,免疫荧光法检测肺组织LC3蛋白表达水平,免疫组化法检测肺组织LC3、Beclin-1及ATG5蛋白表达水平,RT-qPCR检测肺组织自噬关键基因LC3、Beclin-1、ATG3、ATG5、ATG7及ATG12 mRNA转录水平。结果显示,经黄芩苷治疗后能显著缓解H6N6亚型禽流感病毒对小鼠肺组织的损伤,血清中IL-1β、IL-2、IL-6及TNF-α含量显著下降(P<0.01),肺组织中自噬体数量减少,LC3、Beclin-1、ATG5及ATG7蛋白表达水平显著下降(P<0.01),肺组织中LC3、Beclin-1、ATG3、ATG5、ATG7及ATG12 mRNA转录水平显著下降(P<0.01)。结果表明,黄芩苷能减轻H6N6亚型禽流感病毒诱导小鼠肺脏炎症损伤,同时下调自噬关键因子及自噬体的水平,提示其抗小鼠肺损伤机制可能与调控细胞自噬有关。

《兽医病理学》实验教学方法改革探索

《兽医病理学》是动物医学专业的专业基础课,也是基础兽医学与临床兽医学之间的桥梁学科。实验教学是《兽医病理学》教学的重要内容,是培养学生专业素养、动手能力和创新性思维的重要途径。通过实验教学内容及环节的改革有效提高了学生的动手能力和对兽医病理学理论知识的理解。该文针对《兽医病理学》实验教学中存在的问题,进行了实验性改革和分析。

鸡滑液囊支原体TaqMan实时荧光定量PCR方法的建立及应用

为了快速、准确检测鸡滑液囊支原体(MS),对MS标准株vlhA基因进行分析,设计并合成特异性引物和探针,优化反应条件,构建了基于vlhA基因的TaqMan实时荧光定量PCR快速检测方法。结果显示,所构建方法标准曲线所对应的相关系数R^(2)=1.000,斜率S=-3.452,截距I=43.950,表明标准质粒浓度与Ct值的线性关系良好;该方法除MS外,其他参考菌(毒)株均无目的基因扩增,其最小检测浓度为1×10^(1)copies/μL,组内重复及组间重复的变异系数均低于0.1;运用所建立方法与普通PCR方法对4份疑似MS临床样本进行检测,检测结果完全相符合;应用该方法对贵州省7个地区107份疑似MS样本进行检测,发现总体阳性率为26.17%。说明建立的方法具有较好的特异性、敏感性和重复性,可应用于临床检测。

鸡毒支原体PstS蛋白的原核表达及其定位

通过SOE-PCR技术获得PstS基因全长并克隆到pColdⅠ,将重组表达载体pCold-PstS转化进BL21(DE3)后经IPTG诱导表达融合蛋白PstS,将其纯化后免疫新西兰兔制备多克隆兔抗血清,提取鸡毒支原体总蛋白、膜蛋白和胞浆蛋白,通过Western blot分析PstS蛋白的亚细胞定位.结果表明,PstS基因长度为1065 bp,其蛋白在氨基酸9~31之间存在跨膜区,pCold-PstS经诱导表达获得融合蛋白PstS(存在于细胞膜和胞浆中),其约43 ku并具有较好的抗原性.PstS蛋白是鸡毒支原体膜表面的免疫原性蛋白,可为进一步研究其生物学功能和基因工程疫苗提供依据.

澳洲坚果油脂对脂多糖诱导小鼠肠道损伤的改善作用研究

澳洲坚果油(MO)富含单不多饱和脂肪酸,尤其是棕榈油酸,具有多种生物活性。研究采用脂多糖(LPS)构建小鼠肠道损伤模型,探究澳洲坚果油脂对肠道损伤的改善作用及其机理。将小鼠随机分为4组:对照组(CON)、MO组[2.5 mL/(kg·d)]、LPS组(5 mg/kg)、LPS+MO组,检测小鼠空肠组织病理变化、抗氧化指标、Toll样受体4/细胞核转录因子(TLR4/NF-κB)基因炎性因子、空肠组织病理学变化、细胞凋亡及炎症通路关键因子表达水平。结果表明:澳洲坚果油改善了LPS诱导的小鼠肠道病理形态;与LPS组相比,LPS+MO组显著增强了总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平(P<0.01),降低了丙二醛(MDA)水平(P<0.01);LPS+MO组TLR4和NF-κB mRNA转录水平以及NF-κB蛋白表达水平显著低于LPS组;MO显著抑制了LPS诱导的肠道促炎因子肿瘤坏死因子-α(TNF-a)和白细胞介素-6(IL-6)表达水平(P<0.01)。因此,澳洲坚果油具有改善LPS诱导的小鼠急性肠道损伤作用,与提高肠道抗氧化水平和抑制TLR4/NF-κB通路有关。

毕节地区6个绵羊品种FecB基因微卫星座位多态性研究

FecB(Fecundity Booroola)是羊繁殖性状的主效基因,该文旨在探讨贵州毕节地区6个绵羊品种FecB基因微卫星座位多态性及与湖羊和威宁绵羊杂交品系繁殖性状的相关性.首先采集6个品种绵羊血浆,提取基因组DNA,选择位于FecB基因中的6个微卫星座位,设计引物,运用聚合酶链式反应扩增微卫星基因序列,以聚丙烯酰胺凝胶电泳银染技术施以微卫星分型.比较各组之间FecB微卫星基因型与等位基因分布,并进行多态性分析.结果显示:6对微卫星引物均能在6个羊群组中稳定扩增.微卫星座位LSCV043,BMS2508,300U,GC101,Bulge5和471U均能检测到3~6个等位基因.其中等位基因114 bp在微卫星座位LSCV043中频率最高;等位基因162 bp在微卫星BMS2508中频率最高;等位基因164 bp在微卫星座位300U中频率最高;等位基因200 bp在微卫星座位GC101中频率;等位基因136 bp在微卫星座位Bulge5中频率最高;等位基因200 bp在微卫星座位471U中频率最高.多态信息含量(PIC)结果显示:300U,GC101两个微卫星座位在各组羊群中均属于高度多态水平(PIC>0.5),而471U座位在各组羊群中均为中度和低度多态基因座.微卫星座位300U在湖羊与威宁绵羊杂交品系中等位基因数为5个,其中基因型148/160 bp对应的最小二乘平均值最高,达到了1.81只;微卫星座位GC101基因型200/238 bp对应的最小二乘平均值最高,达到了1.74只,可用于高繁绵羊的初步辅助选择.

刺五加多糖对雏鸡脾脏中T、B淋巴细胞定位分布的影响

为了研究雏鸡注射不同浓度刺五加多糖(ASPS)后脾脏中T、B淋巴细胞定位分布的变化情况,将60只1日龄雏鸡随机分为3组:对照组、低剂量组和高剂量组,每组20只,10日龄起对低、高剂量组雏鸡分别皮下注射免疫50和200 mg/m L的ASPS 0.2 m L,对照组雏鸡以相同方式注射等体积的生理盐水,连续注射4 d。于末次免疫后第7天和第14天,从每组中分别随机选取5只雏鸡,取其脾脏制作冰冻切片,采用免疫组织化学方法检测CD3+T淋巴细胞和Bu-1+B淋巴细胞的定位分布。结果显示,与对照组比较,低、高剂量组在注射后的7 d和14 d ASPS均能增加脾脏中CD3+T淋巴细胞和Bu-1+B淋巴细胞的数量,由CD3+T淋巴细胞构成的脾脏特征性结构-动脉周围淋巴鞘(PALS)的面积也显著增加,红髓中CD3+T淋巴细胞也明显增多,分布范围逐渐增加;同时,由Bu-1+B淋巴细胞构成的椭球周围淋巴鞘(EALS)的面积也明显增加,红髓和白髓中的浆细胞数量显著增多,并在注射后14 d时出现生发中心。与对照组比较,高剂量组和注射后14 d时上述变化趋势更为明显。结果表明,ASPS能够增加脾脏中T、B淋巴细胞的数量,并且能够影响其在PALS、EALS等脾脏特征性结构中的定位分布,从而从组织学角度进一步证明ASPS对鸡免疫功能具有显著的增强作用。

鸡免疫器官中Th1和Th2型细胞因子mRNA转录水平的比较

为了研究鸡免疫器官中细胞因子的基础转录水平,本试验采用SYBR Green I实时荧光定量PCR方法,检测56日龄鸡免疫器官中Th1类细胞因子及Th2类细胞因子的m RNA相对表达量并进行比较。结果显示,4种细胞因子在盲肠扁桃体中的表达水平均高于腔上囊。脾脏中细胞因子表达水平总体上较同为外周免疫器官的盲肠扁桃体低。胸腺、脾脏与腔上囊中IFN-γ与IL-4的表达呈负相关性。研究表明,盲肠扁桃体作为可直接参与免疫反应的外周免疫器官,其免疫活性可能较中枢免疫器官腔上囊更高。IFN-γ与IL-4作为最具代表性的Th1与Th2类细胞因子,其表达表现为相互抑制。

泛素基因沉默对TLR4/NF-κB信号通路中关键分子表达的影响

为了探讨泛素(ubiquitin,简称Ub)对TLR4/NF-κB信号通路中关键分子表达的影响,通过脂质体将短发夹RNA(shRNA)质粒转染猪小肠上皮细胞,使其泛素基因沉默,于转染后6、12、24、48 h收集细胞及其上清。应用荧光定量PCR检测细胞内TLR4/NF-κB信号通路中关键分子TLR4、NF-κB、MyD88、IκB-α的mRNA表达水平,应用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测NF-κB、IκB-α及炎性因子TNF-α、IL-1含量的变化。结果显示,shRNA质粒有效地抑制了泛素基因的表达,转染shRNA质粒后,TLR4/NF-κB信号通路中TLR4、NF-κB、MyD88和IκB-α的mRNA表达量及NF-κB、IκB-α、TNF-α和IL-1含量均普遍呈下降的趋势,说明泛素在炎性因子的释放中起着至关重要的作用,泛素基因的沉默能够抑制该通路的活化。

苏丹红Ⅰ对大鼠CYP1A1、CYP2E1和CYP3A1基因表达及ALT和AST活性的影响

为探讨苏丹红Ⅰ(Sudan Ⅰ)对大鼠肝脏细胞色素P450酶系CYP 1A1、CYP 2E1和CYP 3A1基因表达的影响及ALT和AST活性的变化情况,将30只清洁级SD大鼠随机分为5组:对照组和Sudan Ⅰ处理组(包含四个剂量处理组),连续饲喂10 d,采集肝脏和血液作为检测样品。结果显示,Sudan Ⅰ处理组在一定剂量范围内,CYP 1A1、CYP 2E1和CYP 3A1基因的表达量呈上升的趋势,显著高于C组(P<0.01,P<0.05);ALT和AST的活性随着Sudan Ⅰ剂量的增加,呈现上升的趋势,且显著高于C组(P<0.05,P<0.01)。该结果提示,Sudan Ⅰ影响了CYP 1A1、CYP 2E1和CYP 3A1基因的表达以及ALT和AST的变化,从而发挥毒性,最终导致机体中毒,肝脏损伤。

关于小儿手足口病的预防和控制对策分析

目的总结小儿手足口病的预防和控制对策,为小儿传染病防治工作提供参考。方法选择90例手足口病患儿,总结患儿具体治疗情况,分析预防、控制措施。结果 90例手足口病患儿治疗总有效率为91.11%,退热时间均值为(2.50±0.60)d、住院时间均值为(3.60±1.10)d。结论有效的预防以及控制利于手足口病患儿的治疗以及康复。

苏丹红I对大鼠CYP 2E1、CYP 3A1酶活性、CYP 450含量及血液成分的影响

【目的】为探讨苏丹红I(Sudan I)对大鼠肝脏细胞色素P450酶系CYP 2E1和CYP 3A1活性的影响及血液指标的变化。【方法】将30只清洁级SD大鼠随机分为2组:对照组和Sudan I处理组(包括4个剂量处理组),连续饲喂10 d,采集肝脏和血液作为检测样品,运用酶活性测定技术和血液成分进行分析。【结果】Sudan I能够诱导CYP 2E1、CYP 3A1酶活性及CYP 450s表达增加(P <0. 05,P <0. 01),使红细胞数和血红蛋白的量表现为减少,白细胞数和血小板的量表现为增加。【结论】Sudan I能导致大鼠CYP 2E1、CYP 3A1酶活性、CYP 450含量及血液成分的变化,引发毒性效应导致肝脏受损。

撒坝猪源大肠杆菌高致病性毒力岛诱导病理损伤的超微结构特征

为探究撒坝猪源大肠杆菌(E.coli)高致病性毒力岛(HPI)诱导小鼠病理损伤的超微结构特征,本研究将实验室保存的E.coli HPI阳性株(HPI^(+))和E.coli HPI基因缺失株(ΔHPI)进行复苏和培养,分别用E.coli HPI^(+)、E.coli^(Δ)HPI菌株以腹腔接种的方式感染昆明小鼠,检测菌株的半数致死量(50%lethal dose,LD50),通过HE染色和透射电镜观察并分析菌株对小鼠病理损伤的超微结构特征,利用免疫组织化学标记白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)阳性细胞在被感染小鼠肝脏和肾脏组织中的分布,以反映E.coli HPI+及E.coliΔHPI菌株所引起炎症水平的差异。结果显示,E.coli HPI^(+)和E.coli^(Δ)HPI菌株的半数致死量分别为1×10^(7.39)和1×10^(8.62)CFU/mL;HE染色显示,E.coli感染小鼠后,可见肝脏细胞肿胀、变性,肝窦淤血,肾脏间质淤血,肾小管上皮细胞变性脱落等病理变化;超微结构变化显示,肝脏细胞的完整形态消失,胞核呈不规则形态,线粒体畸形,粗面内质网上核糖体脱落,滑面内质网增生;多数肾小管上皮细胞出现胞核固缩,部分细胞核核仁边移、体积增大,足突融合,系膜细胞间隙变宽。此外,E.coli HPI^(+)感染组小鼠于肝脏、肾脏的水肿现象较E.coli^(Δ)HPI菌株感染的小鼠更为明显。免疫组化结果显示,大肠杆菌感染小鼠后,IL-1β蛋白主要表达于肝细胞、中央静脉周围、肾间质细胞和肾小管上皮细胞,且E.coli HPI^(+)感染组的IL-1β表达量高于E.coli^(Δ)HPI感染组。综上所述,撒坝猪源E.coli HPI能够调控E.coli对小鼠的致病性,HPI的调控作用可使E.coli对小鼠肝脏、肾脏造成的病变及超微结构变化更明显,并且能够增加小鼠的炎症反应。

浅析动物医学专业兽医病理学课程思政教学融入措施

兽医病理学是动物医学专业的基础学科和临诊学科结合点上的一门桥梁学科。课堂教学是课程思政教育的重要渠道,专业课程是课程思政建设的基本和重要的载体。教改结合本学科的特点和地区人才培养需求,通过加强学生临床生产实践、常见病的病理诊断,改革传统教学模式,并结合适宜的切入点引入课程思政教学等多个维度,对兽医病理学课程建设和教学改革进行探索和实践,便于学生掌握动物疾病病理变化、认识疾病发生发展及规律。

核桃蛋白多肽对脂多糖诱导的小鼠急性肝损伤的保护作用

构建脂多糖(LPS)诱导小鼠急性肝损伤模型,研究核桃蛋白多肽(WPP)对肝损伤的保护作用。实验小鼠随机分为5组(空白对照组,LPS模型组,LPS+WPP低、中、高剂量组),连续灌胃WPP 5周后,采用尾静脉注射LPS诱导肝损伤,检测各处理组小鼠肝脏指数、血清中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活性、肝组织中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性、组织病理学变化以及血清中炎症因子白细胞介素IL-1β和IL-6水平。结果表明:与LPS模型组相比,WPP高剂量组肝脏指数显著降低(P<0.05),WPP中、高剂量组小鼠血清中ALT和AST活性极显著下降(P<0.01),WPP低、中、高剂量组小鼠血清中IL-1β和IL-6含量极显著下降(P<0.01),WPP中、高剂量组小鼠肝组织中SOD活性显著升高(P<0.05),WPP低、中、高剂量组小鼠肝组织中GSH-Px活性极显著升高(P<0.01);组织病理学观察发现,WPP低、中、高剂量组小鼠肝组织病理损伤明显减轻。WPP对LPS造成的小鼠急性肝损伤具有明显的保护作用。

苏丹红Ⅰ对大鼠十二指肠CYP 1A1和CYP 2E1基因表达的影响

探讨苏丹红Ⅰ(SudanⅠ)对大鼠十二指肠细胞色素P4501A1(CYP 1A1)和细胞色素P450 2E1(CYP2E1)表达的影响。将30只清洁级SD大鼠随机分为2组,对照组(C组)和SudanⅠ处理组(包括4个剂量组:Ⅰ组265mg/kg,Ⅱ组530mg/kg,Ⅲ组795mg/kg,Ⅳ组975mg/kg),连续饲喂10d,采集十二指肠作为检测样品,应用免疫组化染色技术(IHC)与原位杂交技术(ISH)研究SudanⅠ对十二指肠CYP 1A1、CYP 2E1表达的影响。结果显示,SudanⅠ处理组十二指肠CYP 1A1、CYP 2E1基因表达的积分光密度极显著高于C组(P<0.01),且在一定剂量范围内数据呈现上升趋势。说明SudanⅠ能够诱导CYP 1A1、CYP 2E1的表达增加,从而发挥各种毒性效应,最终导致肠道损伤。