鸡胚背根神经节的摘取方法及培养条件的改进优化

探讨摘取鸡胚DRG的有效方法,并对培养条件进行优化,为神经营养因子突起鉴定奠定基础。根据鸡胚DRG的生长状态和解剖特点,采用分部摘取法摘取鸡胚DRG,利用NGF对不同部位的DRG进行鉴定,同时通过不同血清浓度、不同培养基及不同观察时间鸡胚DRG神经突起的生长状态,对培养条件进行优化。结果显示分部摘取法摘取鸡胚DRG提高了实验的可操作性和可重复性;综荐骨部的鸡胚DRG为实验最佳取材部位;无血清RPMI-1640培养基为最适神经突起生长鉴定培养基。

可视化教学在医学机能实验学示教环节中的应用

医学机能实验教学是高等医学院校基础医学实验教学的一个重要组成部分,在培养学生实践动手能力方面具有重要作用。随着医学院校的不断扩招,西部高校出现教师和学生比例严重失调、实验教学资源不足等问题。针对该问题,我校机能实验中心引入可视化教学系统,将高清摄像机与信息化信号采集与处理系统相连,实现视频图像采集同步功能,将老师的示教操作过程通过投影仪进行放大,使每位学生坐在座位上就可以清晰地看到老师的每一步操作。不但激发了学生的学习兴趣,还使学生在学习的过程中更加积极主动的进行学习,操作技能水平和考核成绩均得到了显著提高。

留学生机能实验学中团队协作精神的培养

来自不同国家的医学留学生由于其文化、信仰、行为习惯等方面存在很大的差异,学生之间交流少,集体观念不强,团结协作精神差,在机能实验课表现尤为突出。针对该问题,代课教师通过在实验各个环节给学生创造更多交流机会,团队协作机会的方式,培养学生团队协作精神,增强学生们的集体荣誉感,教学质量得到显著提高。

连接蛋白40在正常和自发性高血压大鼠脾脏T淋巴细胞中的表达差异

目的:探讨T淋巴细胞表面连接蛋白40(Connexin 40,Cx40)在正常Wistar京都(Wistar-Kyoto,WKY)大鼠和自发性高血压大鼠(Spontaneous Hypertension Rat,SHR)脾脏的表达差异。方法:应用流式细胞仪技术,检测Cx40在WKY大鼠(n=12)和SHR(n=12)脾脏中CD4^+和CD8^+T淋巴细胞的表达比例。结果:与WKY大鼠比较,SHR脾脏中CD4^+Cx40表达比例升高(<0.01),CD8^+Cx40表达比例也升高(<0.01)。结论:Cx40在SHR脾脏CD4^+和CD8^+T淋巴细胞表面的表达比例升高可能参与高血压炎症过程。

大数据背景下关于医学研究生生物信息学课程改革的思考

在生物医学大数据背景下,生物信息学虽已成为医学院校研究生教育中的重要课程,但该课程现有的教学模式和课程内容已无法满足科研与社会需求,基于该课程本身显著的实践性特点,笔者结合目前生物信息学在医学类院校研究生教育中所存在的普遍问题,提出自己对于该课程教学体系和课程内容改革的建议和方法,为培养科研临床综合型、创新型医学人才提供某些参考。

基于OBE理念的药学专业《人体解剖生理学》课程的混合式教学改革

人体解剖生理学作为一门研究人体正常形态结构及功能活动规律的学科,既是药学专业的专业必修课,也是该专业学生学习其他专业课程、理解药物作用机制的重要基础。本文针对该课程的教学现状及存在的问题,通过重构课程目标和多元化考评体系、建设多元化课程资源、运用多元化教学模式和完善师资培养,积极开展并实施了以学习成果和能力产出为导向、以突出医学生理药理有机融合为特点的混合式教学改革,以期提升学生综合能力素质和解决专业相关问题的基本科学思维能力,为培养创新型药学专业人才、实现国家新时代高等教育改革发展目标发挥引领示范作用。

淋巴细胞亚群在不同周龄自发性高血压大鼠和正常大鼠脾脏中的表达差异

目的研究T淋巴细胞亚群在不同周龄的自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat,SHR)和正常Wistar京都(Wistar-Kyoto,WKY)大鼠脾脏中的表达差异。方法选取16周龄和40周龄雄性SHR和WKY大鼠各8只,监测血压后,通过苏木素-伊红(HE)染色观察大鼠脾脏病理学变化,应用流式细胞术检测WKY大鼠和SHR脾脏中T淋巴细胞亚群的表达变化。结果与相同周龄WKY大鼠比较,SHR脾脏中央动脉血管壁增厚,管腔狭窄,且40周龄SHR脾脏病变较16周龄严重;相同周龄的SHR与WKY大鼠比较,脾脏中CD3+、CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴细胞比例均无统计学差异(P>0.05);与16周龄WKY大鼠比较,40周龄WKY大鼠脾脏CD3+和CD3+CD8+T淋巴细胞比例显著降低(P<0.01),CD3+CD4+T淋巴细胞比例和CD4+/CD8+比值显著升高(P<0.01);40周龄SHR脾脏CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴细胞以及CD4+/CD8+比值的变化趋势同WKY大鼠相一致。结论高血压可引起脾脏病理改变,但其对脾脏T淋巴细胞亚群比例可能无显著影响,然而随着周龄的增加,脾脏T淋巴细胞亚群均发生紊乱。

毕赤酵母表达Neuritin蛋白的纯化及鉴定

为研究重组Neuritin的毕赤酵母表达蛋白的纯化方法及鉴定。应用甲醇诱导GSll5/pPIC9K-Neuritin毕赤酵母工程菌株表达Neuritin蛋白,采用硫酸铵盐析、His-Trap Crud亲和层析等方法,对该表达产物进行纯化。纯化后的蛋白进行SDS-PAGE、western-blot和生物质谱鉴定。结果显示,SDS-PAGE分析显示经甲醇诱导后表达的蛋白获得了与Neuritin分子量理论值相符的条带,western-blot分析它能够与抗表位抗体特异反应,进一步生物质谱分析证实该纯化重组蛋白为Neuritin重组蛋白。由此可知,本研究建立了一种有效的纯化方法,获得高纯度的Neuritin重组蛋白,为大量制备Neuritin纯化蛋白,开展其功能和机制研究奠定基础。

Neuralized siRNA表达载体的构建及鉴定

目的构建Neuralized siRNA干扰载体并观察其对细胞中Neuralized表达水平的影响。方法化学合成靶向Neuralized的短发夹寡核苷酸序列,与线性化pGPU6/Neo质粒退火连接。酶切后测序鉴定正确,转染入HEK293细胞。利用Western blot和间接免疫荧光技术分析Neuralized siRNA载体对细胞中Neuralized表达及其定位的影响。结果 Neuralized siRNA干扰载体经酶切及测序分析表明,目的核苷酸序列成功插入预计位点且序列正确;Neuralized siRNA干扰载体转染HEK293细胞后,Western blot检测显示,Neuralized siRNA干扰载体明显降低细胞中Neuralized蛋白表达;间接免疫荧光显示,转染4种Neuralized siRNA均能使定位于细胞膜上的Nneuralized蛋白的荧光强度变暗。结论 Neuralized siRNA干扰载体成功构建,且能明显抑制细胞中Neuralized的表达。

肺动脉高压大鼠肺部炎症与CD4^+T淋巴细胞上Cx40、Cx43的相关性研究

目的:探讨肺动脉高压大鼠肺组织炎症的变化与CD4^+T淋巴细胞上连接蛋白(Cx) 40、43表达的相关性研究。方法:选取12周龄雄性SD大鼠12只,随机分为对照组和肺动脉高压(PAH)组,野百合碱(MCT)溶液一次性腹腔注射60 mg/kg,4周造模成功后,记录右心室肥厚指数(RVHI),HE染色观察大鼠肺脏病理学变化,ELISA方法检测肺组织中IL-6、TNF-α的表达,流式细胞术检测T淋巴细胞CD4/CD8的表达比率以及CD4^+T淋巴细胞上Cx40、Cx43的表达变化。结果:与对照组比较,PAH组右心室重量与RVHI升高; PAH组肺脏中小动脉血管壁增厚,炎性细胞浸润,PAH组大鼠肺中小型动脉的管壁厚度占血管外径的百分比(WT%)和肺动脉管壁面积与管总面积的百分比(WA%)均增高(P<0. 05);肺动脉高压大鼠肺组织匀浆中细胞因子IL-6和TNF-ɑ表达水平上调(P<0. 05); PAH组CD3^+T淋巴细胞比例升高(P <0. 05),PAH组CD4^+/CD8^+升高(P<0. 05); PAH组CD4^+T淋巴细胞上Cx40、Cx43表达显著增高(P<0. 01),肺组织匀浆中细胞因子IL-6、TNF-α与CD4^+T淋巴细胞上Cx40和Cx43高表达呈显著正相关(P<0. 05)。结论:MCT诱导的肺动脉高压引起的肺部炎性改变可能与T淋巴细胞上连接蛋白表达增高有关。

雌激素抑制淋巴细胞IL-1β和IL-6释放并下调Cx40及Cx43水平

目的 探讨雌激素(E)对淋巴细胞上连接蛋白40(Cx40)和Cx43表达及白细胞介素1β(IL-1β)和IL-6释放的影响。方法 选取Wistar京都(WKY)大鼠6只,采集腹主动脉外周血,分离淋巴细胞进行培养,分为空白组(Ctrl)、刀豆蛋白A(ConA)组和刀豆蛋白A+雌激素(ConA+E)组。应用ELISA检测培养基上清液中IL-1β、IL-6的水平;应用免疫荧光技术检测淋巴细胞上Cx40和Cx43的表达和分布情况;应用流式细胞术检测淋巴细胞上Cx40和Cx43表达水平变化;应用Western blot检测淋巴细胞上Cx40和Cx43的蛋白表达。结果 ConA组IL-1β和IL-6表达较Ctrl组升高(P<0.01),ConA+E组较ConA组降低(P<0.01,P<0.05);免疫荧光结果显示Cx40主要表达在细胞质及细胞核,而Cx43主要表达在细胞膜,ConA组淋巴细胞上Cx40和Cx43蛋白表达较Ctrl组升高(P<0.01),ConA+E组较ConA组降低(P<0.01);ConA组淋巴细胞上Cx40和Cx43表达水平较Ctrl组升高(P<0.01,P<0.05),ConA+E组较ConA组降低(P<0.05);ConA组淋巴细胞上Cx40和Cx43蛋白表达较Ctrl组明显升高(P<0.01),ConA+E组较ConA组明显降低(P<0.01)。结论 E抑制炎症因子IL-1β和IL-6的释放,同时下调淋巴细胞上Cx40和Cx43的表达,提示Cx40和Cx43可能参与E的抑炎作用。

脂联素对脓毒症小鼠心肌损伤的保护作用及其机制

目的探讨脂联素(APN)是否对脓毒症所导致的心肌损伤有保护作用及其可能的机制。方法选取30只健康的C57BL/6J雄性小鼠,质量控制在(25±5)g,随机分成3组,每组10只,分别为假手术组(sham组)、脓毒症心肌损伤组(LPS组)、脂联素干预组(APN+LPS组)。应用HE染色观察小鼠心肌组织损伤情况,免疫组织化学染色和Western blot观察连接蛋白43(Cx43)、半胱氨酸蛋白酶3(Caspase3)、Bcl-2-associated X(Bax)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)等相关蛋白的表达水平。结果与sham组相比,LPS组小鼠心脏损伤表现明显,Bax、活化的Caspase3(cleaved-caspase3)蛋白表达增高,Bcl-2蛋白表达降低,与LPS组比较,APN+LPS组损伤明显减轻,且Bax、cleaved-caspase3蛋白表达降低,Bcl-2蛋白表达升高,且与sham组相比,LPS组Cx43表达升高,LPS+APN组Cx43表达降低。结论脂联素可以减轻LPS诱导的脓毒症小鼠心脏损伤,其机制可能是通过抑制凋亡信号通路以及Cx43的表达来实现的。

一氧化氮对自发性高血压大鼠外周血T淋巴细胞亚群的影响

目的探讨一氧化氮(NO)对调节外周血T淋巴细胞亚群的比值和促炎因子的影响及其对高血压造成的靶器官损伤的作用。方法选取12周龄SHR和WKY大鼠,随机分为WKY组、SHR组和SHR+NO干预组,每组6只,SHR+NO干预组按10μg/(kg·d)腹腔注射硝普钠(NO供体)4周,WKY组和SHR组用等量生理盐水腹腔注射4周。测量尾动脉血压后,采用HE染色法观察脑基底动脉和肾脏病理学改变;流式细胞术检测外周血CD4^+/CD8^+和CD4^+CD25^+T细胞比值;ELISA检测外周血血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平。结果与WKY组比较,SHR组大鼠出现脑基底动脉内皮细胞受损、血管壁增厚、肾小球萎缩和炎性细胞浸润,SHR+NO干预组较SHR组大鼠炎性损伤程度减轻;与WKY组比较,SHR组大鼠外周血CD4^+/CD8^+的比值升高(P<0.01),CD4^+CD25^+的比值下降(P<0.01),SHR+NO干预组较SHR组CD4^+/CD8^+的比值降低(P<0.01),CD4^+CD25^+的比值升高(P<0.05);SHR组大鼠血清中TNF-α表达较WKY组升高(P<0.01),SHR+NO干预组较SHR组TNF-α表达降低(P<0.05)。结论 NO通过调节外周血T淋巴细胞亚群的比值,减少促炎因子的释放,进而改善高血压造成的靶器官损伤。

一氧化氮抑制大鼠T淋巴细胞TNF-α和IL-6的释放并下调连接子蛋白40(Cx40)水平

目的探讨一氧化氮(NO)对淋巴细胞上连接蛋白40(Cx40)表达及肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6)释放的影响。方法取WKY大鼠腹主动脉外周血,收集淋巴细胞进行体外培养,分为对照组、伴刀豆球蛋白A(Con A)处理组、Con A联合NO处理组。ELISA检测培养基上清中TNF-α和IL-6水平,免疫荧光技术检测淋巴细胞Cx40的表达和分布,流式细胞术检测淋巴细胞Cx40表达频率的变化,Western blot法检测淋巴细胞Cx40的蛋白水平。结果与对照组相比,Con A处理组TNF-α和IL-6水平升高,Con A联合NO处理组较Con A处理组降低;Cx40表达在淋巴细胞的细胞质和细胞核,与对照组相比,Cx40蛋白表达水平和表达频数均增加,与Con A处理组淋巴细胞相比,Con A联合NO处理组Cx40蛋白表达水平和表达频数均明显降低。结论 NO抑制促炎因子TNF-α和IL-6释放,同时伴随下调淋巴细胞上Cx40的表达,提示Cx40可能参与NO的抑炎作用。

阻断连接子蛋白43(Cx43)抑制脂多糖诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞M1型极化

目的研讨连接子蛋白43(Cx43)在脂多糖(LPS)诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞M1型极化中的作用。方法将体外培养的小鼠RAW264.7巨噬细胞分为对照组、LPS组、LPS联合Cx43阻断剂模拟肽19(Gap19)或模拟肽26(Gap26)预处理组(LPS联合Gap19组、LPS联合Gap26组)。Western blot法检测小鼠RAW264.7巨噬细胞Cx43和M1型极化标志物CD86、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的蛋白水平,免疫荧光细胞化学染色观察CD86在RAW264.7巨噬细胞的表达和定位,流式细胞术检测小鼠RAW264.7巨噬细胞M1型极化标志物CD86的表达频数。结果与对照组相比,LPS组中CD86、iNOS和Cx43的蛋白表达明显升高,CD86的表达频数明显升高;与LPS组相比,在LPS联合Gap19组和LPS联合Gap26组中CD86和iNOS的蛋白表达均显著降低,CD86的表达频数均显著降低。因此,LPS可以诱导小鼠RAW264.7巨噬细胞向M1型极化,而Gap19和Gap26能够降低M1型极化标志物的表达。结论通过阻断Cx43可以抑制巨噬细胞M1型极化。

Neuritin siRNA表达载体的构建及对细胞中Neuritin表达的影响

为构建neuritin siRNA干扰载体并观察对细胞中neuritin表达水平的影响。采用化学合成法获取靶向neu-ritin的短发夹寡核苷酸序列,与线性化pGPU6/Neo质粒退火连接。转化后获取的neuritin siRNA经酶切及测序鉴定正确后,转染293T细胞。Western-Blot和间接免疫荧光分析观察构建的neuritin siRNA载体对细胞中neu-ritin表达及其定位的影响。neuritin siRNA干扰载体经酶切及测序分析的结果显示,目的核苷酸序列成功插入了预计位点且序列完全正确。neuritin siRNA干扰载体转染293T细胞后,Western-Blot检测显示,neuritin siRNA干扰载体明显降低了细胞中neuritin基因的蛋白表达;间接免疫荧光结果显示,4种neuritin siRNA明显减弱了定位于细胞膜上的neuritin蛋白的荧光强度(其中neuritin siRNA4的抑制效果最为明显)。由此可知,neuritin siRNA干扰载体成功构建,且能明显抑制细胞中neuritin的表达。

连接子蛋白43(Cx43)抑制氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的大鼠胸主动脉平滑肌细胞自噬

目的探讨连接子蛋白43(Cx43)在氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞(VSMC)自噬中的作用。方法采用α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)免疫荧光细胞化学染色鉴定原代VSMC,ox-LDL处理后,采用油红O染色鉴定泡沫细胞;Western blot法检测(0、40、80、160)μg/mL ox-LDL处理0、6、12、24 h,VSMC中微管相关蛋白1轻链3(LC3)蛋白的表达以及80μg/mLox-LDL干预24 h,Cx43蛋白的表达;将VSMC随机分为对照组、ox-LDL组和ox-LDL联合Cx43特异性阻断剂Gap26组,Western blot法检测各组细胞LC3、beclin 1的表达。结果分离的细胞α-SMA阳性率达95%以上,与对照组相比,ox-LDL处理的细胞油红O阳性细胞明显增加,ox-LDL呈浓度依赖及时间依赖地降低LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值及beclin 1蛋白表达,Cx43蛋白的表达明显升高;给予Gap26后,可上调LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值及beclin 1蛋白表达。结论Cx43抑制ox-LDL引起的自噬。

硫氢化钠抑制大鼠外周血淋巴细胞TNF-α和IL-6的释放并下调连接子蛋白40(Cx40)和Cx43水平

目的探讨硫氢化钠(NaHS)对淋巴细胞连接子蛋白40(Cx40)和Cx43表达及肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6)释放的影响。方法选取清洁级Wistar京都(WKY)大鼠6只,采集腹主动脉外周血;密度梯度法分离淋巴细胞,分为对照组、伴刀豆球蛋白A (ConA)组、ConA联合NaHS组。ELISA检测培养细胞上清中IL-6和TNF-α的水平,免疫荧光染色技术检测淋巴细胞Cx40、Cx43表达和定位,流式细胞术检测淋巴细胞Cx40、Cx43表达频数,Western blot法检测淋巴细胞Cx40、Cx43的蛋白水平。结果与对照组相比,ConA组IL-6和TNF-α水平升高,ConA联合NaHS组较ConA组降低; Cx40主要表达在细胞质和细胞核,而Cx43主要表达在细胞膜上;与对照组相比,ConA组淋巴细胞Cx40和Cx43表达均明显增强、Cx40和Cx43表达频数及蛋白水平均升高;与ConA组相比,ConA联合NaHS组淋巴细胞Cx40和Cx43表达均降低、Cx40和Cx43表达频数及蛋白水平均降低。结论 NaHS处理抑制ConA处理引起的TNF-α和IL-6释放,下调淋巴细胞上Cx40和Cx43的表达。

β淀粉样蛋白25-35片段最佳损伤建模条件的研究

为探讨淀粉样蛋白25-35片段(Αβ25-35)诱导细胞损伤的最佳条件,为后续Αβ作用机制研究奠定实验基础。采用正常血清培养和血清饥饿培养两种预处理方法,以Αβ25-35为诱导剂,建立SH-SY5Y细胞损伤模型,通过细胞形态学和存活率两个指标来确定损伤模型建立的最佳条件。结果显示,血清在Aβ25-35引起的SH-SY5Y细胞损伤中具有保护作用。由此可知,采用血清饥饿法培养SH-SY5Y细胞,以40μM的Aβ25-35处理细胞48h是建立细胞损伤模型的最佳条件。

雌激素改善高血压靶器官损害与T淋巴细胞连接蛋白40表达的相关性

目的观察雌激素改善高血压造成的靶器官损害与T淋巴细胞连接蛋白40(Cx40)表达的相关性。方法选取16～17周龄雄性自发性高血压大鼠(SHR)和WKY大鼠,SHR随机分为SHR组和雌激素干预SHR组。测量尾动脉压后,采用苏木素-伊红染色观察大鼠脑基底动脉和肾脏组织的病理学改变,应用流式细胞术检测大鼠外周血中CD4^+/CD8^+、CD4^+CD25^+T淋巴细胞比值以及Cx40在CD4^+和CD8^+T细胞的表达比例,应用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血清炎症因子的表达。结果与WKY组相比,SHR组肾脏血管壁增厚,部分血管周围炎性细胞浸润和肾小球萎缩等肾损伤现象明显,雌激素干预组管壁增厚和炎性浸润程度均减弱;与WKY组相比,SHR组大鼠外周血CD4^+/CD8^+值升高(P<0.05),CD4^+CD25^+T细胞占CD4^+细胞比例降低(P<0.01),雌激素干预组较SHR组CD4^+/CD8^+值降低(P<0.05),CD4^+CD25^+T细胞占CD4^+细胞比例增高(P<0.05);与WKY组相比,SHR组外周血CD4^+、CD8^+T淋巴细胞上Cx40表达增高(P<0.01,P<0.05),雌激素干预组较SHR组外周血CD4^+、CD8^+T淋巴细胞上Cx40表达降低(P<0.05);与WKY组比较,SHR组大鼠血清中白细胞介素(IL)6和肿瘤坏死因子(TNF)α表达升高(P<0.05,P<0.01),雌激素干预组较SHR组大鼠血清中IL-6和TNF-α表达降低(P<0.05),而SHR组大鼠血清中IL-10表达低于WKY大鼠(P<0.01),雌激素干预组较SHR组IL-10表达升高(P<0.05)。结论雌激素改善高血压炎症造成的肾脏和脑血管损害可能与其抑制T淋巴细胞上Cx40的表达相关,其可能的机制是雌激素通过下调外周血T淋巴细胞Cx40的表达,抑制细胞间的缝隙连接通讯,进而抑制炎症因子的释放,从而改善高血压造成的靶器官损害。