黑曲霉耐热型葡聚糖酶纤维素结合结构域的替换与融合体酶性质

该文旨在通过更换纤维素结合结构域(cellulose binding domain, CBD)的方式探索获得具有纤维素水解能力的耐热型葡聚糖酶的方法。黑曲霉(Aspergillus niger)来源的葡聚糖酶AnEglA6具有优越的耐热性能,在禽类饲料生产中具有应用前景。通过更换不同家族来源的碳水化合物结合结构域(carbohydrate binding module, CBM)编码区,构建了融合体葡聚糖酶基因,分别在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中进行异源表达。AnEglA6催化结构域与分别来源于嗜热菌(Caldicellulosiruptor kristjanssonii)和荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的木聚糖酶的底物结合结构域CBM9、CBM10结合获得的融合体酶AnEg-CBM9和AnEg-CBM10均具有较高的纤维素水解能力,并且底物范围进一步扩大,对微晶纤维素也具有一定的水解能力。AnEg-CBM10热稳定性有显著的提高,在85℃下酶活力半衰期达到40 min左右,能短时耐受90℃高温。融合体酶AnEg-CBM10是一种热稳定性提高、具有纤维素水解能力的新型葡聚糖酶。

黑曲霉高耐热葡聚糖酶的分子截短与制备条件优化

该文旨在通过分子截短的方式提高高耐热葡聚糖酶AnEglA6的表达水平并针对重组菌建立相应的发酵方法。高耐热β-葡聚糖酶在禽类饲料生产中有着重要作用。黑曲霉来源的葡聚糖酶AnEglA6具有优越的耐热性能,适合在禽类饲料中使用。采用C端截短方式对该葡聚糖酶进行分子精简,构建了去除连接桥和纤维素结合结构域的截短体基因eglA6c,分别在乳酸克鲁维酵母和巴斯德毕赤酵母中进行异源表达获得重组酶AnEglA6cK和AnEglA6cP。乳酸克鲁维酵母表达的重组酶AnEglA6cK最适温度为75℃,在80℃下酶活力半衰期达55 min,能短时耐受85℃高温,应用性能显著优于AnEglA6cP。针对截短体酶AnEglA6cK在发酵后期酶活力快速下降的问题,对发酵条件进行了优化。通过以大豆蛋白胨替代酪蛋白胨的方式延长产酶时间、大幅度提高了摇瓶发酵水平。

纤维微菌β-1,3-葡聚糖酶的克隆表达及对灵芝细胞壁的水解作用

该文旨在研究一种酶解灵芝(Ganoderma lucidum)菌丝体从而提高其胞内蛋白提取效率的方法。通过PCR方法扩增获得纤维微菌(Cellulosimicrobium sp.)CICIM6906的β-1,3-葡聚糖酶编码基因,该基因命名为bgl6906并与表达载体连接,构建重组质粒pET28a-bgl6906,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-bgl6906。重组菌在TB培养基中进行诱导表达,表达产物在自身信号肽引导下大部分分泌到细胞外。以茯苓多糖为底物时,重组酶BGL6906纯酶比酶活力为567.8 U/mg,最适pH为5.5,最适温度为50℃。重组菌在15 L发酵罐中发酵72 h胞外酶活力达到67 U/mL。重组酶BGL6906与果胶酶交替水解灵芝菌丝体培养物,可以有效水解细胞壁,获得部分原生质体。进一步辅助短时超声波破碎可以大幅度提高灵芝胞内产物的释放。

枯草芽孢杆菌普鲁兰酶基因的分泌表达及其在粉丝制作中的应用

作者旨在研究枯草芽孢杆菌普鲁兰酶的分泌表达及表达产物的应用性能。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168菌株的普鲁兰酶编码基因BsP分别在大肠杆菌(Escherichia coli)和枯草芽孢杆菌中进行表达,重组酶在两种宿主中均能利用自身结构分泌到细胞外。重组酶分泌到枯草芽孢杆菌细胞外的产物的酶学性质与积累在大肠杆菌胞质内的产物有明显的差异,分泌到枯草芽孢杆菌细胞外的重组酶BsBsP的比酶活为153.7 U/mg,是大肠杆菌胞质内产物的5.5倍。重组酶BsBsP最适pH为6.0,最适温度为45℃。重组酶BsBsP对直链淀粉无降解作用,为I型普鲁兰酶。在以土豆淀粉为原料的粉丝制作工艺中,以重组酶BsBsP水解芡糊淀粉可以有效降低粉丝断条率。枯草芽孢杆菌普鲁兰酶可利用自身结构实现高效分泌表达,重组酶适用于以淀粉为原料的粉丝制作。