辣椒脉黄病毒P4蛋白多克隆抗体制备与应用

【目的】辣椒脉黄病毒(Pepper vein yellows virus,PeVYV)属马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus),生产上主要侵染辣椒,目前在我国呈现快速扩展态势,因此,亟需开展PeVYV致病性研究,为分析对辣椒的潜在威胁提供依据。以PeVYV编码运动蛋白P4为免疫源,制备多克隆抗体,建立PeVYV P4蛋白特异性检测方法,为PeVYV P4蛋白功能研究奠定基础。【方法】采用RT-PCR技术,从感染PeVYV辣椒cDNA中扩增获得片段大小为471 bp的PeVYV P4基因,并克隆到原核表达载体pDEST17,转化E.coli Rosetta中进行诱导表达,采用Ni-NTA柱层析纯化。以纯化P4蛋白作为抗原免疫新西兰白兔制备多克隆抗体。制备的多克隆抗体采用Western blotting检测。【结果】原核表达的PeVYV P4蛋白,SDS-PAGE表明纯化蛋白为一分子量约为25 kDa的单一条带。Western blotting检测表明,制备的多克隆抗体,特异性的结合P4蛋白。PeVYV侵染辣椒样本检测表明,制备的P4多克隆抗体能特异性检测PeVYV。【结论】制备的PeVYV P4多克隆抗体,可用于特异性检测PeVYV P4蛋白,为进一步深入研究P4蛋白的功能奠定基础。

辣椒脉斑驳病毒湖南分离物全基因组序列测定及分子特征

【目的】辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)是东南亚茄科作物主产地主要病毒种类之一,严重危害辣椒等茄科作物的生产。测定ChiVMV的全基因组序列,分析其分子特征,可以明确该病毒的适应性进化以及对我国辣椒等茄科作物的潜在威胁提供科学基础。【方法】以湖南疑似感染ChiVMV辣椒为样本,采用small RNA高通量测序结合RT-PCR测定病毒全基因组序列,利用Mega、RDP及DnaSP等生物学软件分析其分子特征。【结果】ChiVMV湖南分离物全长基因组序列为9704 nt(不包含3′-A尾),与其他分离物的序列同源性为84%~94%。系统发育分析表明,我国的ChiVMV聚类为一个亚簇,与其他国家和地区分离物不存在重组事件。基因的替换指数R=3.29,替换碱基类型主要是C/T替换。【结论】碱基替换突变可能是ChiVMV湖南分离物适应性进化的主要因素。

云南省番茄莴苣褪绿病毒分子检测及遗传进化分析

采集了77份云南省疑似感染莴苣褪绿病毒(lettuce chlorosis virus,LCV)的番茄样本,采用特异性反转录PCR扩增LCV次要外壳蛋白基因(minor coatprotein,CPm)近全长序列,常规Sanger测序法测定相应片段序列,并对其进行遗传进化分析。结果表明,LCV特异性反转录PCR扩增得到与预期大小(1.38 kb)—致的特异性条带;采集的77份番茄样本中LCV检出率为12.99%。测定的LCV CPm;发育分析表明,所有LCV分离物可分为3个亚簇,具有明显的地域特性,其中LCV云南分离物与中国其他地区LCV分离物聚为一亚簇,来自美洲和欧洲分离物分别聚为一个簇。遗传进化分析表明,LCV云南分离物YN58有1个重组事件,序列中嘧啶(C/T)替换率最高(25.25),呈现独立进化、加速扩展趋势。这是在云南省首次报道发现LCV。