基于代谢组学的痹祺胶囊治疗类风湿性关节炎作用机制研究

目的 利用代谢组学技术探究痹祺胶囊治疗类风湿性关节炎的作用机制。方法 建立II型胶原蛋白诱导的类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)大鼠模型,并进行痹祺胶囊给药干预,取空白组、模型组、给药组大鼠血清,采用UPLCQ-TOF-MS技术对血清进行代谢组学分析,筛选潜在生物标志物,结合人类代谢组学数据库(human metabolomics database,HMDB)和京都基因与基因组百科全书数据库(Kyoto encyclopedia database of genes and genomes,KEGG)富集相关代谢通路并分析痹祺胶囊对生物标记物的干预作用,进而解析其作用机制。结果 代谢组学分析共筛选到18个潜在生物标志物,涉及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成及苯丙氨酸代谢、醚脂代谢、组氨酸代谢、三羧酸循环、精氨酸生物合成等11条代谢通路;痹祺胶囊可改善模型大鼠代谢轨迹的偏离。结论 痹祺胶囊主要通过调节氨基酸代谢、花生四烯酸代谢、甘油磷脂代谢及能量代谢等多条代谢通路,改善内源性代谢物的水平,在机体供能、抗炎及免疫调节过程中发挥作用。

基于模型引导的中药安全用药的研究策略:中药定量毒理学

中医药在人类健康中发挥重要的作用,然而,近年来中药不良反应事件时有发生,如何科学的回答中药安全性问题需要一套有效的研究方案。基于数学模型和定量药理学研究思路,提出中药风险评估的新策略,即中药定量毒理学。中药定量毒理学基于风险评估、风险控制以及毒理学实验方法与定量药理学研究方法之间的相似性,对致毒关键要素、毒性物质及毒性机制进行系统评价,建立数学模型,为药品监管及临床应用提供可推广、可复制的中药质量评控体系及安全用药方案。中药定量毒理学基于现代中药毒性认知,将为中药安全性和风险防控对策提供重要的理论指导,为中医药健康可持续发展提供科学护航。

痹祺胶囊治疗类风湿性关节炎的药效研究及网络机制预测

目的 基于Ⅱ型胶原诱导的类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)大鼠模型和网络药理学方法探讨痹祺胶囊的药效作用及作用机制。方法 SD大鼠采用Ⅱ型胶原蛋白造模,造模成功大鼠随机分为模型组,痹祺胶囊(0.05、0.10、0.20、0.40 g/kg)组及泼尼松(10 mg/kg)组和雷公藤总苷(10 mg/kg)组,连续给药15 d。持续监测大鼠体质量、足趾肿胀度和关节炎评分,苏木素-伊红染色考察大鼠踝关节病理变化,ELISA法测定血清细胞因子含量,初步评价痹祺胶囊治疗效果。选择痹祺胶囊中39个化合物为研究对象,依据反向药效团匹配方法和TCMSP、Uniprot等数据库预测化合物作用靶点,与通过OMIM、Dis Ge Net等数据库收集的RA相关靶点相互交互,将交互靶点借助Omicsbean、STRING等数据库平台对获得靶点进行基因本体功能和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析,利用Cytoscape软件构建“药材-化合物-靶点-通路-功效-疾病”网络,预测其可能的作用机制。结果 与对照组比较,模型组大鼠活动、饮食减少,足趾肿胀、关节呈急性炎症表现,关节炎评分显著增加(P<0.01),血清中类风湿因子(rheumatoid factor,RF)、白细胞介素-17(interleukin-17,IL-17)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、IL-1β和γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ)水平均显著增加(P<0.05、0.01、0.001),IL-10水平降低,脾脏、胸腺指数显著增加(P<0.01、0.001),病理显示膝关节可见滑膜细胞增生、炎性细胞浸润,骨与软骨被侵蚀。与模型组比较,痹祺胶囊组大鼠踝关节病变情况得到不同程度改善,具体可见足肿胀度、关节炎评分显著降低(P<0.05、0.01),血清中RF、IL-17、TNF-α、IL-1β、IFN-γ水平显著降低(P<0.05、0.01、0.001),IL-10水平增高,脾脏、胸腺指数降低(P<0.05、0.01),踝关节骨、软骨组织损伤减轻,炎性细胞浸润、滑膜结缔组织增生减少。网络药理学预测发现,痹祺胶囊39个成分与RA交集靶点共371个。蛋白质-蛋白质相互作用网络分析结果显示,IL-6、白蛋白、TNF、血管内皮生长因子A、基质金属蛋白酶9、趋化因子配体8等124个靶点可能是痹祺胶囊治疗RA的关键靶点。KEGG通路富集分析获得IL-17信号通路、Toll样受体信号通路、Th1和Th2细胞分化、VEGF信号通路、瞬时受体电位通道的炎症介质调节、Wnt信号通路、血小板激活等80条信号通路,与免疫调控、抗炎、抑制血管翳生成、成骨/破骨细胞平衡等过程相关。对网络进行分析发现痹祺胶囊治疗RA具有多成分、多靶点、多途径的特点,其中单体成分士的宁、三七皂苷R_(1)、人参皂苷Rg_(1)、丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅱ_(A)、丹酚酸B、异甘草素、迷迭香酸、阿魏酸等可能为痹祺胶囊的关键药效物质基础。结论 痹祺胶囊对Ⅱ型胶原诱导的RA大鼠模型治疗效果较好,可能通过抗炎、免疫调节、血管生成、骨形成/侵蚀平衡等发挥治疗作用,体现了痹祺胶囊治疗RA多成分、多靶点、多通路的特点。

基于体外细胞模型的痹祺胶囊药效物质基础研究

目的 探究痹祺胶囊祛风除湿、活血止痛功能的药效物质基础。方法 通过建立脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7体外炎症模型、细胞核因子-κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factorκB ligand,RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(macrophage-stimulating factor,M-CSF)与RAW264.7细胞共培养建立破骨细胞分化模型、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)诱导的人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞RA-HFLS增殖模型,分别探讨痹祺胶囊发挥抗炎活性、抑制破骨细胞形成、抑制RA-HFLS细胞增殖的作用机制及药效物质基础。MTS法检测细胞增殖活性,ELISA法检测细胞上清中一氧化氮(nitric oxide,NO)、TNF-α和白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的含量,TRAP染色法检测破骨细胞分化数量,流式细胞术检测细胞凋亡情况,RT-qPCR法检测细胞中组织蛋白酶K(cathepsin K,CTSK)、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)、基质金属蛋白酶-3(matrix metalloproteinase-3,MMP-3)、RANKL mRNA相对表达情况。结果 痹祺胶囊及其19个单体成分均能显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞内NO、TNF-α和IL-6的释放,推测19个化合物是痹祺胶囊发挥抗炎作用的药效物质基础。痹祺胶囊及其13个单体成分均能显著减少RANKL和M-CSF诱导RAW264.7分化为破骨细胞的数量,并能明显降低破骨细胞标志基因CTSK和TRAP的相对表达量,推测马钱子碱、士的宁、党参炔苷、茯苓酸、丹参素、丹酚酸B、迷迭香酸、三七皂苷R_(1)、人参皂苷Rg_(1)、人参皂苷Rb_(1)、藁本内酯、甘草次酸和甘草苷为痹祺胶囊发挥治疗骨破坏、缓解关节疼痛作用的主要物质基础。痹祺胶囊及其9个单体成分能明显抑制TNF-α诱导的RA-HFLS细胞增殖,并且能显著促进RA-HFLS细胞的凋亡以及明显降低MMP-3和RANKL基因的相对表达量,推测马钱子碱、士的宁、丹参素、丹参酮Ⅱ_(A)、阿魏酸、藁本内酯、蜕皮甾酮、次黄嘌呤、甘草次酸为痹祺胶囊中发挥抑制滑膜增生作用的药效物质基础。结论 通过体外细胞实验初步确定马钱子碱、士的宁、党参炔苷、白术内酯Ⅲ、茯苓酸、丹参素、丹参酮Ⅱ_(A)、丹酚酸B、迷迭香酸、三七皂苷R_(1)、人参皂苷Rg_(1)、人参皂苷Rb_(1)、阿魏酸、藁本内酯、蜕皮甾酮、牛膝皂苷D、次黄嘌呤、甘草次酸、甘草苷为痹祺胶囊主要药效物质基础。

基于功能模型的痹祺胶囊药效研究

目的探讨痹祺胶囊全方益气养血、活血通络、抗炎及镇痛作用。方法分别采用大鼠气血两虚模型和微循环障碍模型观察痹祺胶囊的益气养血和活血化瘀作用;采用小鼠急性耳肿模型观察痹祺胶囊的抗炎作用;采用小鼠热板法和扭体模型观察痹祺胶囊的镇痛作用。各功能研究用动物分别分为空白组(扭体实验除外)、模型组(热板实验除外)、阳性药组、痹祺胶囊低剂量组(相当于临床用量)、中剂量组(相当于临床2倍用量)、高剂量组(相当于临床4倍用量)。末次给药1 h后取材,检测全血中外周血细胞数量,采用ELISA法检测血清中促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)含量,采用流式细胞术检测脾脏中CD4^(+)/CD8^(+)比例,用于初步评价痹祺胶囊的益气养血作用;采集大鼠肠系膜毛细血管流速,对全血进行黏度分析,采用凝血酶时间(thrombin time,TT)试剂盒对血清进行凝血时间分析,用于初步评价痹祺胶囊的活血化瘀作用。结果痹祺胶囊低剂量组(相当于临床剂量)具有显著的益气养血及抗炎镇痛作用(P<0.05、0.01),活血化瘀作用不明显;痹祺胶囊中剂量(相当于2倍临床剂量)表现出显著的抗炎及镇痛作用(P<0.05、0.01),益气养血作用较弱,活血化瘀作用不明显;痹祺胶囊高剂量组具有显著的益气养血、活血化瘀、抗炎及外周镇痛作用,中枢镇痛作用不明显,具体表现在可提高外周血细胞数量、外周血中EPO含量及改善脾脏T淋巴细胞CD4^(+)、CD8^(+)分型(P<0.05、0.01),改善毛细血管流速、降低不同切速下全血黏度,并延长TT(P<0.05、0.01),抑制巴豆油引起的耳肿及醋酸诱发的疼痛反应(P<0.05、0.01)。结论痹祺胶囊具有明显的益气养血、活血化瘀及抗炎镇痛作用,并为明确其功能药味奠定药效基础。

基于HPLC指纹图谱及多成分定量测定的痹祺胶囊质量评价

目的建立痹祺胶囊的HPLC指纹图谱及甘草苷、阿魏酸、丹酚酸B的含量测定方法,更为全面地评价痹祺胶囊的质量。方法采用Shiseido Capcell Pak C_(18)MG II色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),指纹图谱以乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相,梯度洗脱,体积流量1.0 mL/min,检测波长203 nm,柱温为35℃,测定19批痹祺胶囊指纹图谱,结合中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行全面分析;含量测定以乙腈-水-0.1%磷酸水溶液(21∶79∶0.1)为流动相;体积流量1.0 mL/min;以二极管阵列检测器检测,甘草苷检测波长为276 nm,阿魏酸检测波长为321 nm,丹酚酸B检测波长为286 nm;柱温为40℃;进样体积均为10μL。结果19批痹祺胶囊指纹图谱相似度大于0.97,共标定了36个共有峰,确认了6号峰为丹参素、10号峰为士的宁、11号峰为马钱子碱、13号峰为甘草苷、14号峰为阿魏酸、15号峰为迷迭香酸、16号峰为人参皂苷Rg1、18号峰为丹酚酸B、20号峰为人参皂苷Rb1、22号峰为甘草酸铵、27号峰为藁本内酯、30号峰为丹参酮IIA、33号峰为茯苓酸13个成分;含量测定中甘草苷、阿魏酸、丹酚酸B进样量在30.35~455.30 ng、5.046~75.690 ng、61.79~926.90ng线性关系良好(均为r=0.9999);平均回收率在98.43%~102.12%,RSD均<2%;19批痹祺胶囊中甘草苷质量分数在0.630~1.428 mg/g,阿魏酸质量分数在0.188~0.260 mg/g,丹酚酸B质量分数在2.539~3.442 mg/g。结论建立的指纹图谱及含量测定方法适用于痹祺胶囊的全面质量评价。

基于UPLC-Q/TOF-MS的痹祺胶囊化学物质组及入血成分的研究

目的采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱联用技术(UPLC-Q/TOF-MS)对痹祺胶囊化学物质组和入血成分进行辨识研究,初步阐明其可能的药效物质基础。方法采用Acquity BEH C_(18)色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm),流动相为乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B),梯度洗脱,体积流量为0.2 mL/min,柱温为30℃,进样量为5μL。采用电喷雾离子源,正、负离子模式扫描。离子源温度为110℃,锥孔电压为30 V,锥孔气体积流量为50 L/h;脱溶剂用氮气,脱气温度为350℃,体积流量为800 L/h;扫描范围为m/z 50~2000。结果在痹祺胶囊样品溶液中鉴定出280个成分,在给药大鼠血浆样品中鉴定出81个化学成分,包括59个原型成分和22个代谢产物。结论对痹祺胶囊及其入血成分进行了较全面地研究,初步阐明痹祺胶囊的药效物质基础,为痹祺胶囊的后续研究提供了理论基础。。

消食退热糖浆解热作用研究

研究消食退热糖浆的解热作用,阐明作用机理,为临床应用提供实验依据。方法:采用酵母致大鼠发热模型,观察消食退热糖浆的解热作用。结果:灌胃给药1次,与模型对照组比较,消食退热糖浆2.13、4.25、8.5g生药/kg剂量组能明显降低大鼠肛温,8.5g生药/kg剂量组能明显降低下丘脑匀浆中PGE2、cAMP及血清中TNF-α、IL-1β含量。

幼龄SD大鼠灌胃给予消食退热糖浆浸膏粉单次给药毒性试验

通过观察PND4 SD大鼠一日内多次灌胃给予消食退热糖浆-浸膏粉后产生的毒性反应和死亡情况,推测消食退热糖浆-浸膏粉灌胃给药的最大耐受量,为预测人体药物过量时可能出现的毒性反应和指导临床合理用药等提供必要参考依据。方法:试验选用40只PND4大鼠(妊娠大鼠分娩所得),20♀/20♂,胎仔出生后4天对仔鼠数进行调整,每窝留4♀4♂,将每窝胎仔随机分到溶媒对照组和供试品组。采用灌胃给药,一日内给药3次,间隔约4h,单次给药容积为20ml/kg。溶媒对照组给予娃哈哈饮用纯净水;供试品组给予消食退热糖浆-浸膏粉,给药浓度为0.28g/ml,累积给药剂量为16.8 g/kg。动物给药日药后定点连续观察,其后每天上、下午各观察1次,连续观察14天;给药前、药后每周测定2次体重;死亡动物和试验结束后所有存活动物进行大体剖检,大体剖检病变器官进行组织病理学检查。结果:对动物临床症状的影响:溶媒对照组与供试品组动物一般状态良好,未见明显临床症状。试验期间无动物死亡。 对动物体重的影响:供试品组雄性动物在药后3天、7天和10天及雌性动物在药后3天和7天体重数值低/增长缓慢,与溶媒对照组比较具有统计学意义上的显著性差异,其他时间动物体重及增长率未见异常。病理学检查结果:试验结束后,所有存活动物进行大体剖检,均未见明显大体病理学改变,未进行组织病理学检查。