家蚕znfhit基因的克隆表达及序列分析

在对家蚕蛹cDNA文库的测序中发现了znfhit(zinc finger HIT)的EST序列(GenBank登录号DY230769)。经过比对发现znfhit全长为1019bp,由297bp的5′端非编码区序列(5′UTR)、462bp的开放读码框(ORF)和260bp的3′端非编码区序列(3′UTR)组成。将该基因的cDNA和家蚕基因组序列比对,此基因由3个外显子和2个内含子组成。ZNFHIT蛋白的疏水性最大值为1.533,最小值为-3.267,且不含跨膜区域。用PCR方法扩增获得znfhit基因,将其克隆至质粒pET-28a上,构建重组质粒pET-znfhit,并在大肠杆菌中大量表达,经镍离子亲和层析纯化得到重组蛋白,质谱鉴定其分子量为21.11KD,为后续研究其功能提供了条件。

家蚕新基因Bmbzj的表达、抗体制备及亚细胞定位

在自建的家蚕蛹cDNA文库中发现了一条新基因序列,GenBank登录号为DY231426。该基因是一个同源性很低的基因,未发现保守结构域,将其命名为Bmbzj。Bmbzj基因全长661bp,由99bp的5′端非翻译区序列(5′UTR)、486bp的开放读码框(ORF)和76bp的3′端非翻译区序列(3′UTR)组成。生物信息学分析结果表明蛋白Bmbzj可能存在跨膜区和信号肽。将该基因插入到载体pGEX-4T-3中,构建了该基因编码的重组质粒pGEX-4T-3-Bmbzj,转化大肠杆菌Rosetta后,IPTG诱导表达了该融合蛋白,并利用亲和层析的方法纯化该重组蛋白,免疫新西兰兔制备多克隆抗体。亚细胞定位实验结果表明该蛋白只存在于细胞质中。