应用聚合酶链式反应鉴定实验细胞的来源种属

目的应用聚合酶链式反应(PCR)鉴定常见细胞的种属来源,以判断培养细胞是否存在种间的交叉污染。方法根据文献报道和NCBI数据库我们得到了32对种属特异性引物,并分别针对10种常见的细胞种属,对这些引物进行特异性和敏感性的筛选;以待检测细胞的基因组DNA为模板进行PCR及后续的琼脂糖凝胶电泳;以不同种属来源细胞的DNA混合物作为阳性对照模板,以水作为阴性对照模板。结果针对上述10种常见细胞来源的种属分别得到了1对特异性和敏感性均较好的引物,经PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳后可以准确鉴定待检测细胞的种属来源,并判断该细胞是否存在种间污染。结论应用聚合酶链式反应可以简便、快速地鉴定实验细胞的种属,并判断该细胞是否存在种间的交叉污染。

人肝癌细胞系HepG2和Huh7中的基因组拷贝数变异分析

目的利用人肝细胞癌拷贝数变异和转录组实验,结合临床公共数据,探索肝细胞癌的拷贝数变异对肝癌发生发展的影响。方法用光学基因组图谱技术识别肝癌细胞系HepG2和Huh7中的拷贝数变异,随后分析两种细胞系拷贝数变异基因的功能,并根据富集通路绘制蛋白质相互作用网络。选取两个细胞系核心网络中的关键基因,分析肝细胞癌拷贝数变异与基因表达之间的关系。GEPIA数据库分析基因表达与患者临床生存的关系。用RNA-seq实验和公共数据验证基因的表达水平。结果HepG2细胞主要存在拷贝数增加,相关基因富集在雌激素信号通路、金黄色葡萄球菌感染等通路;Huh7细胞系中既有拷贝数增加又有减少,相关基因主要富集嗅觉传导、细胞因子-细胞因子受体相互作用等通路。关键基因SRC、MAPK3和MAP3K7拷贝数与基因表达成正比,并且高表达这些基因的患者生存期显著降低(P<0.05)。相比于HEK293T细胞系,SRC、MAP3K7基因在两个肝癌细胞系的表达显著升高(P<0.001),提示了肝细胞癌的特异性变异,MAPK3无差异。结论肝细胞癌拷贝数变异基因SRC、MAP3K7的表达与患者的预后显著相关,可能影响肝细胞癌的发生发展和异质性。

联合使用聚合酶链式反应和培养法可以提高培养细胞支原体的检出率

目的分析国家实验细胞资源共享服务平台及其他实验室细胞支原体污染的情况,探讨聚合酶链式反应(PCR)和培养法在实验细胞支原体检测中的一致性。方法通过PCR法对245例细胞培养上清进行了支原体检测,并检测了阳性样品支原体感染的种类;对其中127例新鲜上清同时进行了培养法检测,通过Mc Nemar检验分析了二者的一致性。对二者检测不一致的细胞进行复检,同时使用生物发光法进行验证。结果国内培养细胞支原体感染率在19%~66%;培养法和PCR法检测支原体只有假阴性,没有假阳性;延长取样前细胞在无抗生素培养基中的培养时间至96h,可以提高低效价支原体感染样品的检出率。结论 PCR法和培养法检测支原体具有较好的一致性,应联合使用两种方法对培养细胞进行定期检测,提高支原体的检出率。在细胞培养过程中使用合格制剂,严格无菌操作,预防为主。

国内建立的人肿瘤细胞系的身份认证问题及对策

目的为国内建立的人肿瘤细胞系进行身份认证,确认这些细胞系使用的可靠性。方法收集、整理国内实验室建立的人肿瘤来源细胞系,提取细胞的基因组DNA,PCR扩增其中的多个短串联重复序列(STRs)位点后进行毛细管电泳,分析获得细胞的STR图谱作为细胞系的DNA指纹,然后与原始组织或国际数据库中已有细胞的STR谱进行比对,通过匹配度的高低判断该细胞是否被其他细胞交叉污染。对怀疑He La细胞污染的肿瘤细胞,检测其基因组中是否有人乳头瘤病毒18型(HPV-18)病毒插入片段。对怀疑T细胞白血病细胞污染的,则检测T细胞的各种特性(表面标志),根据表面标志表达情况判断是否为错误细胞。结果本研究共收集了37种国内建立的肿瘤细胞系46个样品。本中心建立的6株细胞系均STR正确。其他单位建立的细胞系中有8株系正确,有23(62. 2%)株系认定为错误细胞,人宫颈癌细胞He La是主要污染源;另外发现有些国内自建的细胞系被人结直肠癌细胞HCT-8、宫颈鳞癌细胞Si Ha、T细胞白血病细胞CCRF-CEM及大鼠细胞污染。结论国内建立的肿瘤细胞很高比例地发生了细胞间的交叉污染,科研人员在实验前一定要首先进行细胞身份认定,或者从国家实验细胞资源共享服务平台选择细胞。另外,建立细胞系时保留原始组织用于后续细胞系的身份认证。

160例非人源细胞系的种间交叉污染情况分析

目的分析常见的非人源细胞系种间交叉污染情况。方法收集160例常见的非人源细胞系,提取基因组DNA,通过PCR法鉴定其来源种属,判断是否存在种属间的交叉污染。对可疑细胞进一步通过染色体分析确认其来源种属。结果 160例非人源细胞中,有6个细胞系的种属鉴定结果与预期种属不符,其中1例大鼠来源细胞混入了人来源细胞,其余5例种属不正确,认定为错误细胞。结论细胞系的种属鉴定是细胞质量控制的不可或缺的环节,只有经过完整质控的细胞才能作为实验材料,用于科学研究和应用。

小鼠子宫颈癌U14细胞系的建立及生物学特性研究

目的:建立小鼠宫颈癌肿瘤细胞系,观察其生物学特性。方法:采用肿瘤原代培养法对小鼠U14肿瘤进行体外传代培养,定期对培养细胞进行形态学观察,进行免疫组织化学鉴定、细胞周期检查、染色体检测、细胞生长测定,进行615、C57BL/6j小鼠移植观察体内成瘤情况,并用pEGFP-N1质粒转染U14细胞。结果:细胞呈贴壁和悬浮混合生长,CK阳性特征。体外连续培养10个月,传代50代,细胞倍增时间为21.83h,细胞周期测定G1期为34%,G2期为26.4%,S期为39.6%。培养U14细胞3～4天处于对数生长期,染色体为亚四倍体核型,众数为64～84条。615小鼠、C57BL/6j小鼠移植成瘤率均为100%,无支原体污染。建立了GFP(+)的U14-GFP单克隆细胞株。结论:成功建立了小鼠U14子宫颈癌细胞系及GFP标记的U14-GFP细胞株,体内移植可建立常规及带荧光标记的肿瘤模型,可用于体内体外相结合的肿瘤研究。

乳腺癌组织细胞的高效原代培养及其特性

目的高效扩增乳腺癌组织细胞,明确其特性,为乳腺癌深入研究及个体化治疗提供实验材料。方法利用小鼠胚胎成纤维细胞3T3swiss作饲养层细胞,培养基中添加ROCK抑制剂Y-27632,对乳腺癌组织细胞进行原代培养。CCK-8检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞周期;免疫细胞化学检测细胞CK分子表达;RT-PCR检测HER-2,ER,PR及乳腺癌干细胞相关标志分子(如CD44,CD24等)mRNA的表达;STR检测以明确细胞身份。结果在饲养层细胞和Y-27632抑制剂同时存在的情况下,所培养的乳腺癌组织细胞增殖速度较快,可短时间获得大量细胞;细胞呈多角形上皮样,CK、HER-2、ER表达阳性,PR不表达;CD44和CD24表达阳性;经STR分析证明其身份正确。结论饲养层细胞及ROCK抑制剂有助于乳腺癌组织细胞的原代培养及大量扩增,扩增的细胞性质稳定,可用于个体化治疗研究。

细胞融合通过PI3K-AKT通路降低黑色素瘤细胞增殖能力

目的研究细胞融合在黑色素瘤细胞增殖中的作用及其分子机制。方法用聚乙二醇细胞融合方法融合黑色素瘤细胞,通过流式分选获得稳定的融合细胞。体外培养及细胞计数检测融合细胞的增殖速度。Affymatrix基因芯片分析差异表达的基因,IPA软件进行基因功能分析。Western blot检测细胞蛋白。结果 PEG化学融合法成功获得稳定的黑色素瘤融合细胞,其体外增殖速度明显减慢(P<0.01)。黑色素瘤融合细胞与增殖相关的PI3K-AKT通路明显下调(P<0.01)。融合细胞phospho-S6蛋白表达明显降低。结论细胞融合通过PI3K-AKT通路降低黑色素瘤细胞增殖能力。

分化抑制蛋白Id-1在胃癌分化中的表达及作用

目的:研究Id-1蛋白与肿瘤分化程度的关系,选取临床病理分化程度诊断明确的胃癌组织芯片作为主要研究对象,确定Id-1蛋白在胃癌组织中的分布状况及该蛋白与胃癌病理学分级(分化程度)的相关性;利用体外实验模型,通过诱导分化,改变胃癌细胞的分化状态,进一步研究Id-1蛋白在体外是否随着胃癌细胞分化程度的改变而改变,确定Id-1蛋白在胃癌分化中的作用。方法:通过免疫组织化学法检测Id-1蛋白、Ki-67抗原在胃癌组织芯片表达;通过形态观察、细胞化学染色(PAS)观察丁酸钠(sodium butyrate,NaB)对人低分化胃癌细胞MGC803诱导分化,利用细胞免疫化学染色、Western-blot研究诱导分化前后Id-1蛋白表达的改变。结果:胃癌组织中Id-1蛋白检测总阳性率为88.8%,Id-1蛋白在高、中、低分化癌中阳性率分别为77.4%、97.0%、92.0%,有显著性差异(P<0.001);Ki-67抗原的总阳性表达率达78.7%,在高、中、低分化癌中阳性率分别为64.5%、90.9%、80.0%,有显著性差异(P<0.001);组间比较Id-1蛋白与Ki-67抗原表达呈正相关。NaB在体外作用于MGC803细胞后细胞体积变大,核浆比变小,伸展状态好,细胞中PAS阳性物质显著减少,出现分化状态改善的现象,分化后的MGC803细胞内Id-1蛋白表达减少。结论:Id-1蛋白表达与胃癌分化程度呈负相关,可作为辅助诊断胃癌分化的标记物。

CCC-HPF-2细胞基因组DNA可作为STR分型标准物质

目的检测细胞培养传代过程中的基因稳定性,筛选符合中国人遗传特性的DNA标准物质,建立DNA标准细胞库。方法通过显微镜下观察、免疫组织化学、核型分析检测细胞传代过程中形态、分子表达及核型是否稳定;应用PCR方法检测细胞的外源微生物及种属来源;STR检测验证细胞在传代过程中STR表达谱的平衡性及稳定性。结果 CCC-HPF-2细胞呈成纤维细胞样;波形蛋白表达阳性,CK阴性;无外源微生物污染;细胞来源于人;所有15个STR基因座都得到扩增,呈现较好的扩增平衡性,各代细胞STR表达谱一致,表现了高度稳定性。结论 CCC-HPF-2细胞来源于人,30代内的该细胞DNA可作为STR分型标准物质。

多克隆同步筛选及验证胰腺癌肺转移细胞亚群

目的利用混合多克隆细胞亚群筛选和验证分析具有肺转移能力细胞亚群和基因。方法混合多克隆细胞亚群,分别尾静脉接种于喂饮强力霉素和对照两组裸小鼠,取小鼠肺原代培养得到具有肺转移能力的胰腺癌细胞亚群;提取基因组DNA进行PCR分析,比较两组小鼠特异基因检测率。结果体内筛选肺癌转移显示不加强力霉素组裸鼠出现肺转移症状早和严重。肺原代培养成功得到具有转移能力的胰腺癌细胞亚群,基因组DNA PCR分析表明75.0%没有喂饮强力霉素小鼠肺转移检测到SQSTM1基因,而在喂饮强力霉素小鼠只有37.5%肺转移检测到SQSTM1基因。PCR分析其他候选基因,包括sema4b,ube2k和gna13,均未检测到。证实强力霉素介导的SQSTM1基因表达导致胰腺癌细胞不同肺转移能力。结论多克隆混合同步筛选可验证得到胰腺癌肺转移细胞亚群和与其关联的基因。

小鼠子宫颈癌U14细胞系的建立及生物学特性研究(英文)

目的:建立小鼠宫颈癌肿瘤细胞系,观察其生物学特性。方法:采用肿瘤原代培养法对小鼠U14肿瘤进行体外传代培养,定期对培养细胞进行形态学观察,进行免疫组织化学鉴定、细胞周期检查、染色体检测、细胞生长测定,进行615、C57BL/c小鼠移植观察体内成瘤情况,并用pEGFP-N1质粒转染U14细胞。结果:细胞呈贴壁和悬浮混合生长,CK阳性特征。体外连续培养10个月,传代50代,细胞倍增时间为21.83小时,细胞周期测定G1期为34%,G2期为26.4%,S期为39.6%。培养U14细胞3-4天处于对数生长期,染色体为亚四倍体核型,众数为64～84条。615小鼠、C57BL/c小鼠移植成瘤率均为100%,无支原体污染。建立了GFP(+)的U14-GFP单克隆细胞株。结论:成功建立了小鼠U14子宫颈癌细胞系及GFP标记的U14-GFP细胞株,体内移植可建立常规及带荧光标记的肿瘤模型,可用于体内体外相结合的肿瘤研究。

抗CD20单链抗体融合显性抗原肽的原核表达和其抑瘤活性研究

目的:人工设计并表达美罗华(C2B8)单链可变区抗体与李斯特菌溶细胞素O(Listeriolysin O,LLO)显性抗原表位构成的重组融合蛋白(Sc Fv-p LLO),初步分析其抗淋巴瘤细胞活性。方法:查询数据库获得美罗华(C2B8)单抗VH和VL基因序列,构建抗CD20单链抗体(Sc Fv)基因序列,选取LLO的2个CD4+T细胞表位,构建单链抗体融合抗原表位的重组蛋白基因序列,克隆至原核表达载体,经诱导表达纯化,流式细胞术和免疫共沉淀分析其与淋巴瘤细胞结合能力,细胞增殖实验测定其对淋巴瘤细胞生长的影响,凋亡实验分析其诱导淋巴瘤细胞凋亡的能力,淋巴细胞增殖实验分析其免疫原性。结果:成功诱导表达重组蛋白Sc Fv-p LLO。Sc Fv-p LLO可不同程度地靶向结合不同淋巴瘤细胞系,并明显抑制Raji细胞生长和诱导其凋亡。Sc Fv-p LLO可刺激免疫小鼠脾细胞增殖。结论:重组蛋白Sc Fv-p LLO保留了Sc Fv的功能,可靶向结合和抑制CD20阳性淋巴瘤细胞的生长,同时可激活机体免疫应答,为进一步研究其模拟瘤细胞表面抗原和作为瘤细胞疫苗佐剂的功能奠定基础。

应用组织特异性分子的保守序列鉴定人源细胞的组织来源

目的建立一种有效简便经济的检测方法,用于鉴定培养细胞的组织来源,对新鲜取材细胞归类,检测细胞组织来源。方法根据文献报道与NCBI数据库,设计17对组织特异性相关引物,分别针对16个常见的人类组织特异性因子的mRNA保守序列,培养细胞,提取mRNA,反转录为c DNA,以此为模板进行PCR,琼脂糖凝胶电泳分析;对这些引物进行特异性和敏感性的筛选;其中8对引物可用于判断人类组织特异性,以双盲实验对此方法进行验证,用于鉴定人类细胞的组织来源。结果 17对组织特异性相关引物中,特异性分子ALB、AFP、SYN、CDH16、SFTPB、LCA、FLT和MUL2的对应引物可有效应用于鉴定细胞是否源自肝、肾、神经、肺、造血、内皮和分泌组织;特异性因子PSA对应引物可广泛在人类各组织细胞中扩增出条带;鉴定其他组织的引物有待进一步研究完善优化。结论应用反转录聚合酶链式反应扩增编码组织特异性分子mRNA的保守序列可以准确鉴定待检测细胞的组织来源。本研究为鉴定常见细胞的组织来源提供新方法。

Cas9稳定表达人肿瘤细胞株的建立及其基因编辑活性

目的：建立多种Cas9蛋白稳定表达的人肿瘤细胞株，验证细胞中Cas9的基因编辑活性，方便后续研究中目的基因的编辑。方法在15种来自不同组织的人肿瘤细胞株中通过慢病毒感染pLv-EF1α-Cas9-Flag-Neo或pLv-EF1α-Cas9-Flag-Puro及克隆筛选的方式建立Cas9稳定表达的细胞株；在其中3个细胞株中瞬时转入靶向TSC22基因的向导RNA，挑选单克隆，通过基因组PCR、测序及Western blot检测Cas9蛋白的基因编辑活性。结果筛选得到了69株Cas9稳定表达的人肿瘤细胞株，瞬时转入向导RNA后成功造成了细胞中TSC22基因的大片段缺失。结论成功建立了69株Cas9稳定表达的人肿瘤细胞株，其中的Cas9蛋白具有基因编辑活性。这些细胞株在大规模药物筛选、新药作用靶点的筛选以及基因功能研究等方面有潜在应用价值。

分化抑制蛋白1在小鼠树突状细胞肉瘤细胞分化中的作用

目的 研究降低分化抑制蛋白1（Id-1）的表达在树突状细胞肉瘤（DCS）细胞分化中的作用。方法 通过RNA干扰技术来降低DCS细胞株中Id-1蛋白的表达，Western blot和real-time PCR分别检测该蛋白在蛋白水平和mRNA水平上的变化；倒置显微镜下观察降低Id-1蛋白表达后DCS细胞形态的变化；Casy细胞计数分析仪检测细胞大小的分布情况；流式细胞仪检测细胞周期的变化。通过Westernblot和免疫组织化学检测树突状细胞的分化标志如Id-2、CD86、CD11c、MHC Ⅱ的变化。生长曲线及四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测DCS细胞的增殖情况的变化；通过Transwell和克隆形成率测定分别观察降低Id-1蛋白前后细胞侵袭、成瘤能力的变化。以不加siRNA的空白组和无关对照siRNA作阴性对照，以诱导分化剂丁酸钠作为阳性对照。结果 降低Id-1蛋白表达后DCS细胞分枝增多，细胞体积明显增大，核质比下降，G0／G1期细胞增多，S期细胞减少（P〈0．01），树突状细胞分化标志Id-2、CD86等表达上调，细胞增殖受到抑制，侵袭、成瘤能力减弱（P〈0．01）。结论 通过RNA干扰技术降低Id-1基因的表达，可以促进恶性实体肿瘤细胞的分化，降低恶性程度。

人乳腺癌细胞系中上皮型钙黏连蛋白表达对其黏附和增殖的影响

目的 探讨上皮型钙黏连蛋白（E-cadherin,E-cad）表达对MDA-MB-231人乳腺癌细胞黏附力及增殖的影响.方法 采用脂质体转染方法将携带有E-cad基因的重组真核表达质粒E-cadpcDNA3转染入E-cad阴性MDA-MB-231人乳腺癌细胞系,通过G418筛选,Western blot法鉴定出E-cad过表达的阳性单克隆细胞株.分别通过三种不同的黏附试验检测E-cad转染前后细胞自身黏附、与基质黏附及与其他细胞黏附能力的变化：免疫沉淀法检测表达的外源性E-cad能否与内源性连环蛋白（β-catenin,β-cat）发生相互作用.Western blot检测E-cad表达后细胞内β-cat、细胞周期蛋白（cyclin）D1蛋白的表达变化;MTT法检测细胞的生长和增殖能力状况;流式细胞仪检测转染E-cad前后细胞凋亡变化情况.免疫细胞化学直接二步法检测β-cat定位变化.结果 通过稳定转染,获得了稳定表达E-cad的两个细胞株Ecad-231-7和Ecad-231-9.MDA-MB-231细胞在不贴壁培养时大部分呈单细胞状态,而两个表达E-cad的细胞株都形成大细胞团;MDA-MB-231、Ecad-231-7和Ecad231-9与HCT116细胞共孵育30 min后的平均黏附率分别为39.0%、60.0%和59.5%.MDA-MB-231细胞在EDTA作用5 min后的平均脱落率为37.4%,Ecad-231-7和Ecad-231-9细胞分别下降为4.2%和7.2%,即E-cad表达后乳腺癌细胞的自身黏附力、与基质的黏附力及与其他细胞的黏附力均增强;且细胞内过表达的外源性的E-cad与β-cat结合,使细胞内cyclin D1表达下降,细胞增殖受到抑制.常规培养48 h后MDA-MB-231、Ecad-231-7和Ecad-231-9细胞的凋亡率分别为1.9%、2.0%和2.1%,E-cad表达对细胞的凋亡没有明显影响.二步法染色显示胞质内β-cat增加.结论 成功建立了稳定表达E-cad蛋白的单克隆细胞株Ecad-231-7和Ecad-231-9.表达的E-cad通过β-cat-cyclinD1途径增强癌细胞黏附力、抑制癌细胞增殖.

GDC-0941联合AZD6244对KRAS突变非小细胞肺癌细胞的增殖抑制作用

目的探讨选择性P13K抑制剂联合MEK抑制剂对携带KRAS／VI＇EN双突变的非小细胞肺癌细胞系NCI-H157的生长增殖和凋亡的影响及相关分子机制。方法常规培养NCI-H157细胞并分别用不同浓度的P13K抑制剂GDC-0941和MEK抑制剂AZD6244单独或联合作用，四甲基偶氮唑盐（MTT）法初步观察对细胞生长增殖的影响。根据观察结果确定联合给药的浓度。然后分为无药对照组、P13K抑制剂单独用药组（GDC-0941，0．5和5．0μmol／L）、联合I组（0．5μmol／LAZD6244＋0．5μmol／LGDC-0941）及联合Ⅱ组（5．0μmol／LAZD6244＋5．0μmol／LGDC-0941）。细胞经过不同的作用后，MTT法绘制增殖抑制曲线；平板集落形成法检测集落形成能力的改变；流式细胞仪检测细胞凋亡率及周期分布；Westernblot检测不同组中抑制剂靶点下游周期及凋亡相关蛋白表达的差异。结果抑制剂单独作用于NCI-H157细胞可抑制其生长增殖。联合用药组与P13K抑制剂单独用药组相比，细胞的生长增殖抑制作用增强，联合I组表现为两药协同作用，联合Ⅱ组表现为两药相加作用；集落形成能力下降[（77．20±1．54）个／孔比（61．50±2．12）个／孔。P〈0．01]和[（51．004-4．00）个／孔比（22．50±3．53）个／孔，P〈0．01]；凋亡率增加[（18．30±0．82）％比（21．32±0．56）％，P〈0．01]和[（27．14±1．58）％比（42．45±4．42）％，P〈0．01]；细胞周期发生改变，联合用药组G0／G1期细胞增加，S期细胞减少（P〈0．05）。Westernblot显示，联合用药组与P13K单独用药组相比，eyelinD1、eyelinB1表达量减少，p21表达量和PARP剪切增加，bel-2／bax的比值下降。结论P13K抑制（AZD6244）可协同MEK抑制（GDC-0941）诱导NCI-H157细胞发生生长增殖抑制和凋亡，但联合用药效果受到药物剂量的影响。

喉鳞状细胞癌细胞系的建立及其生物学特性研究

目的原代培养喉鳞状细胞癌组织细胞，观察其生物学特性。 方法采用组织块法对喉鳞状细胞癌组织细胞进行原代培养，体外传代观察，传代25次以上对培养细胞进行形态学观察、角蛋白组织化学染色、细胞周期检测、培养法进行支原体检测、PCR法细胞种属鉴定、短串联重复序列（short tandem repeat, STR）分型。 结果新建立的喉鳞状细胞癌细胞系命名为TR-LCC-1，肿瘤细胞形态大部分呈多边形，似铺路石样排列，失去接触抑制而重叠生长，细胞体积大，异形性明显。细胞角蛋白染色阳性。体外连续培养6个月，传代30次以上，细胞倍增时间为201.2 h。细胞周期测定G1期为51.71%，S期为44.56%，G2期为2.28%。支原体检测无支原体污染。细胞种属鉴定TR-LCC-1为人来源细胞。STR检测分析P26与P6相同，且与已公开细胞的STR不同。 结论建立了来源于喉鳞状细胞癌的细胞系TR-LCC-1，可用于喉鳞状细胞癌的肿瘤实验研究。