田蓟苷下调TLR4/Myd88/NF-κB信号通路抑制NLRP3炎症小体和炎症反应

本研究通过脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导RAW264.7细胞建立炎症反应模型,探讨田蓟苷(tilianin)对炎症反应的影响及其作用机制。通过CCK-8(cell counting kit-8)实验检测细胞活力,酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)检测肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白细胞介素6(interleukin6,IL-6)含量;Griess试剂法检测一氧化氮(nitricoxide,NO)含量;2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯(2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)荧光探针检测细胞内活性氧(reactive oxygen radical,ROS)水平;Western blot检测Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)、髓样分化因子88(myeloid differentiation primary response gene 88,Myd88)、核转录因子-κB p65(nuclear factor-κB p65,NF-κB p65)、磷酸化核转录因子-κB(phospho-nuclear factor-κB,p-NF-κB)、NF-κB抑制蛋白α(inhibitor of NF-κBα,IκBα)和磷酸化NF-κB抑制蛋白α(phospho-inhibitor of NF-κBα,p-IκBα)的蛋白表达水平;qRT-PCR法和Western blot检测Nod样受体蛋白3(Nod-like receptor protein 3,NLRP3)、IL-1β前体(pro-IL-1β)、IL-18前体(pro-IL-18)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1前体(pro-caspase-1)的mRNA和蛋白水平。免疫荧光染色检测NF-κB p65核转位;使用TLR4抑制剂resatorvid(TAK242)进一步验证田蓟苷对TLR4/Myd88/NF-κB信号通路的影响。结果显示,田蓟苷显著降低了RAW264.7细胞上清中TNF-α、IL-6和NO水平以及细胞内ROS含量。田蓟苷降低了TLR4、Myd88、p-NF-κB p65和p-IκBα蛋白表达水平,抑制了NF-κB p65的核转位,同时显著降低了NLRP3、pro-IL-1β、pro-IL-18和pro-caspase-1的蛋白表达水平以及NLRP3和pro-IL-1β的mRNA水平。上述研究结果表明,田蓟苷能明显减轻LPS诱导RAW264.7细胞产生的炎症反应,其机制可能与下调TLR4/Myd88/NF-κB信号通路从而抑制NLRP3炎症小体有关。

香青兰总黄酮通过VEGF-B/AMPK通路缓解氧化应激抗H9c2细胞缺血再灌注损伤

香青兰总黄酮(total flavonoids of Dracocephalum moldavica L.,TFDM)是从维吾尔医药传统药材香青兰中提取分离出来的有效部位,香青兰具有补益心脑、活血化瘀等功效,长期广泛用于治疗心脑血管疾病。本研究旨在确定香青兰总黄酮对H9c2(大鼠心肌细胞)细胞缺氧复氧(hypoxia/re-oxygenation,H/R)损伤的影响及其作用机制。采用缺氧缺糖9 h合并复氧复糖2 h建立H9c2细胞缺氧/复氧损伤模型,模拟心肌缺血再灌注心肌损伤,考察香青兰总黄酮对细胞活力、心肌细胞损伤标志物、氧化应激水平、活性氧自由基(reactive oxygen radical,ROS)含量的影响,并应用Western blot法检测血管内皮生长因子B(vascular endothelial growth factor B,VEGF-B)和磷酸腺苷激活蛋白激酶[adenosine 5'-monophosphate(AMP)-activated protein kinase,AMPK]通路相关蛋白表达。结果显示,香青兰总黄酮显著提高H/R损伤后心肌细胞活力,减少细胞上清中乳酸脱氢酶和肌酸激酶同工酶含量。显著降低丙二醛,增高超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性、降低细胞内ROS和一氧化氮含量。Western blot分析显示,香青兰总黄酮降低H/R损伤H9c2细胞的BCL-2关联X蛋白水平,上调B淋巴细胞瘤-2基因表达。香青兰总黄酮上调VEGF-B/AMPK通路相关蛋白VEGF-B、血管内皮生长因子受体1、神经纤毛蛋白1、过氧化物酶体增殖物活化受体γ共激活因子1α、磷酸化AMPK、磷酸化的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白水平。上述研究结果表明,香青兰总黄酮能够明显减轻心肌细胞H/R损伤,其机制可能与上调VEGF-B/AMPK通路抑制氧化应激反应有关。

香青兰有效部位对OGD/R损伤诱导的人脑微血管内皮细胞程序性坏死的作用机制研究

本研究旨在探讨香青兰有效部位(effective parts of Dracocephalum moldavica,EPDM)通过抑制程序性坏死通路对缺血再灌注损伤人脑微血管内皮细胞(human brain microvascular endothelial cells,HBMECs)的保护作用和分子机制。泛半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂Z-VAD-FMK联合氧糖剥夺/复氧(oxygen-glucose deprivation/re-oxygenation,OGD/R)损伤建立HBMECs程序性坏死模型,以模拟脑缺血再灌注损伤过程。细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)检测细胞活力;Hoechst 33342/PI荧光双染检测细胞程序性坏死率;试剂盒法检测乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)含量;采用2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯探针、钙黄绿素乙酰甲酯和JC-1探针分别检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)、线粒体膜通透性转化孔(mitochondrial permeability transition pore,MPTP)开放情况以及线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP);酶联免疫吸附实验检测肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)释放情况;免疫印迹法检测程序性坏死相关蛋白表达。结果表明,与对照组比较,Z-VAD-FMK联合OGD/R可使HBMECs活力下降,程序性坏死率升高,LDH释放增加,ROS产生增多,MPTP开放,MMP降低,TNF-α、IL-1β以及IL-6分泌增加,受体相互作用蛋白3(receptor interacting protein kinase 3,RIP3)和线粒体丝氨酸/苏氨酸磷酸酶5(phosphoglycerate mutase 5,PGAM5)表达升高,磷酸化混合系结构域样蛋白(phospho-mixed lineage kinase domain-like protein,p-MLKL)/MLKL比值升高;而EPDM预保护可部分逆转这些因素的变化。上述结果表明,EPDM可能通过抑制RIP3/MLKL/PGAM5通路和MPTP开放以保护线粒体功能,进而使HBMECs免受脑缺血再灌注损伤,可为EPDM治疗脑缺血性相关疾病提供有价值的科学依据。

香青兰有效部位对OGD/R损伤诱导的人脑微血管内皮细胞保护作用研究

目的 采用泛半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteine aspartic acid protease, Caspase)抑制剂Z-VAD-FMK联合氧糖剥夺/复氧(oxygen-glucose deprivation/re-oxygenation, OGD/R)建立体外脑缺血再灌注损伤模型,探讨了香青兰有效部位(effective parts of Dracocephalum moldavica, EPDM)对人脑微血管内皮细胞(human brain microvascular endothelial cells, HBMECs)的保护作用。方法 CCK-8法检测细胞活力,倒置显微镜下观察细胞形态,NO测定试剂盒检测NO含量,transwell法检测细胞迁移情况,免疫荧光检测血管内皮-钙黏蛋白(VE-Cadherin)的表达情况,免疫印迹检测酪氨酸激酶(SRC)、内皮素-1(ET-1)、紧密连接蛋白Claudin 5、内皮性一氧化氮合酶(eNOS)、及磷酸化eNOS的蛋白表达。结果 与对照组比较,Z-VAD-FMK联合OGD/R可使HBMECs活力下降,细胞形态变差,细胞迁移减少,NO释放量降低,VE-cadherin表达减少,Src、Claudin 5、磷酸化eNOS表达减少,ET-1表达升高;而EPDM预处理可部分逆转Z-VAD-FMK联合OGD/R引起的上述因素的变化。结论 EPDM对体外脑缺血再灌注模型下的HBMECs具有保护作用,可促进细胞增殖、迁移,增强血管舒缩调节能力,并通过增强紧密连接和黏附连接维持屏障功能。