内含子对提高转基因动物基因表达效率的影响

综述了内含子在转基因动物基因表达中的作用，对内源性内含子和异源内含子对转基因表达的影响进行分析，讨论了内含子提高转基因动物基因表达效率的三种可能机制，并指出在表达载体构建中应考虑到内含子的重要性．

转基因动物理论与技术的研究进展

转基因动物的出现,为生命科学研究提供了有力的工具。在过去的十多年里,已建立了许多整合有外源基因的转基因小鼠和大鼠,转基因兔、猪、羊、牛等也已诞生。使得在基础研究和实际应用方面展示出良好的前景。然而由于转基因动物的建立较为复杂、繁琐,需研究的问题也较多。迄今为止,以小鼠为模型的研究中,获得的转基因小鼠一般具有如下特征:

转基因动物乳腺定位表达重组蛋白质的研究现状(上)

介绍了转基因动物乳腺定位表达重组蛋白质研究的现状、存在的问题和未来发展前景。

转基因动物乳腺定位表达重组蛋白质的研究现状(下)

转基因动物乳腺定位表达重组蛋白质的研究现状（下）卢一凡邓继先肖成祖马清钧（军事医学科学院生物工程研究所北京１０００７１）四、乳汁中表达产物的特征不论材料的来源如何，如细菌培养物、哺乳动物细胞培养液或转基因动物乳汁，对重组蛋白都需进行纯化，其所需的要求...

乳清酸蛋白(WAP)基因调控序列的鉴定及在小鼠乳腺细胞表达LacZ基因的研究

乳清酸蛋白（ＷＡＰ）是小鼠乳中的主要蛋白质．在亚克隆该基因的基础上，对其进行了酶切鉴定，并对该基因５′区进行克隆和序列分析，在核实序列正确后，构建了以其为调控序列，指导β－半乳糖苷酶基因的真核表达质粒，采用直接注射质粒的方法在小鼠乳腺中表达出β－半乳糖苷酶活性，从而证实基因调控序列的功能正确性，可以用于转基因动物乳腺表达研究，同时证实该方法可以作为一种暂时性表达载体的验证方法．

胚胎发育早期转基因整合的研究

转基因动物的建立是一项复杂而艰苦的工作，在转基因胚移植受体前对其进行检测，无疑对转基因动物建立具有重要意义。使用小鼠乳清酸蛋白（WAP）控制下的人粒细胞激落刺激因子（G-CSF）基因为显微注射片段，采用PCR方法检测了转基因胚，在1、2和8细胞期的阳性率为100％、77．7％和44．4％。为消除PCR扩增中的假阳性结果，构建了两个具有部分同源性的亚克隆片段进行共注射。PCR扩增片段跨越这一同源区域，转基因的非整合胚不能扩增出特异性片段。结果表明，1、2和8细胞期的阳性率分别为11．1％、55．5％和44．4％，较常规PCR检测获得更为明确的结论，为在大动物转基因的检测提供了新依据。

组织纤溶酶原激活剂突变体(La-tPA)转基因鼠的建立

用羊β－乳球蛋白基因（ＢＬＧ）５区５×１０３ｂ（１０３ｂ，旧称ｋｂ）为调控序列，构建了乳腺表达组织纤溶酶原激活剂突变体（Ｌａ－ｔＰＡ）载体．对５４０枚小鼠受精卵进行显微注射，经ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ检测，获得６只整合有人Ｌａ－ｔＰＡ的转基因小鼠，整合率为３２％．

基质结合区与转基因动物的基因表达

基质结合区 (MAR)在稳定转染的细胞系中的研究结果显示 ,能缓冲在其侧翼的染色质某些拮抗作用 .这为外源基因在染色体中随机整合的转基因动物研究提供了新的方向 .文章对其在转基因动物中的探索性研究及可能的机理进行综述 .指出在转基因动物中 ,MAR的应用能导致建立独立的基因活性结构域 .它对基因高效表达无疑具有重要作用 .MAR可能是一种新的顺式作用元件 ,与增强子。

内含子的位置不影响转基因的表达

内含子在转基因动物的基因表达中具有重要作用，以乳清酸蛋白（ＷＡＰ）基因５′区为调控序列，人基因组Ｇ－ＣＳＦ基因为目的片段，将ＷＡＰ基因第一内含子插入Ｇ－ＣＳＦ基因５′端，构建成转基因动物乳腺表达载体。将其直接注射到小鼠乳腺，在泌乳期表达出人Ｇ－ＣＳＦ。表明内含子在５′端的位置不影响转基因的表达，同时也表明内含子对表达有一定的作用。

琼脂糖凝胶直接杂交快速鉴定低拷贝数转基因

采用常规的ＰＣＲ方法检测低拷贝数转基因有一定困难．提出一种使用琼脂糖凝胶直接杂交的方法，结果明确、简单可行，是转基因动物中低拷贝数转基因鉴定的一种较好方法．

人G-CSF转基因鼠的稳定遗传与表达

利用人粒细胞集落刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）基因组基因作为目的片段，将其受控于２．６ｋｂ的小鼠乳清酸蛋白（ＷＡＰ）基因的调控区下，通过显微注射法获得了两只整合有人Ｇ－ＣＳＦ转基因小鼠，通过繁殖建立了稳定的转基因系．一些表型参数测定表明转基因鼠与正常鼠无明显差别．通过ＲＴ－ＰＣＲ及Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ检测，在乳腺表达出人Ｇ－ＣＳＦ，为乳腺表达外源蛋白质及今后大动物研究奠定了基础．

组织纤溶酶原激活剂突变体乳腺表达载体构建及在转基因鼠中表达的研究

通过ＰＣＲ方法从羊肝总ＤＮＡ中获得了羊β乳球蛋白（ＢＬＧ）基因第一和第二内含子，以羊β乳球蛋白基因（ＢＬＧ）５′区５ｋｂ为调控序列，构建了乳腺表达组织纤溶酶原激活剂突变体（ＬａｔＰＡ）载体。对５４０枚小鼠受精卵进行显微注射，经ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ检测，获得６只整合有人ＬａｔＰＡ的转基因小鼠，整合率为３２％。同时研究了转基因在小鼠体内的表达。Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析表明，在一些转基因鼠乳腺中表达出ＬａｔＰＡ。在基因鼠乳汁中检测出ＬａｔＰＡ的表达达６μｇ／ｍＬ。这为未来利用转基因动物生产ＬａｔＰＡ提供依据。

人G-CSF基因组基因的克隆和序列测定

用 PCR方法 ,以提取的正常中国人染色体 DNA为模板 ,成功地扩增出 1 .5kb的人G- CSF基因组基因。将其克隆至 p UC1 9,构建成重组质粒 p GG- 2。在酶切证实正确的基础上 ,将其酶切成三个片段进行了亚克隆。利用 p UC1 9的正反通用引物进行序列分析。自动测序结果表明其编码区的序列是正确的。

限制性内切酶SmaⅠ和HincⅡ存在切割序列多态性

ＰＣＲ扩增产物基因组Ｇ—ＣＳＦ基因被克隆至ｐＵＣ１９，在对其进行序列分析时发现，Ｓｍａ Ⅰ和ＨｉｎｃⅡ共同使用对回收片段进行亚克隆时，有一段序列缺失，序列分析表明这可能是由于Ｓｍａ Ⅰ和Ｈｉｎｃ Ⅱ同时使用造成的。Ｓｍａ Ⅰ和Ｈｉｎｃ Ⅱ可能存在切割序列多态性。

转基因动物鉴定技术的研究进展

转基因动物的建立 ,是一项复杂的系统工程 ,所涉及的环节众多 ,工作量大。而其中重要的一步 ,转基因动物的鉴定 ,则是对在此之前所进行的工作进行检验的关键。选用有效的方法 ,则能迅速、准确地鉴定出转基因。近年来 ,这方面技术发展迅速 ,许多新思路、新方法不断出现 ,本文对此进行了综述。

小麦HMW-GS1D×5基因时间特异性表达的研究

利用小麦高分子量谷蛋白１Ｄ×５亚基探针，研究ＨＭＷ－ＧＳ１Ｄ×５基因表达的规律。结果表明，ＨＭＷ－ＧＳ１Ｄ×５基因从开花初期开始表达。这为从生理、营养、施肥等诸多方面人为地对ＨＭＷ谷蛋白基因的表达加以调控，使之在特定时期能够充分表达该基因从而改善小麦品质打下基础。

快速提取基因组DNA鉴定转基因鼠

剪取鼠尾提取基因组DNA做点杂交、DNA印迹或做PCR,是鉴定转基因鼠常用的方法,而后者因操作简单快速更受青睐。传统的提取基因组DNA方法需要蛋白酶K消化、酚/氯仿抽提、乙醇沉淀等步骤。对于做PCR模板的DNA来说,不需要这些复杂的纯化程序,另外开发更为简洁的方法对于筛选大批量样品快速鉴定转基因鼠无疑具有重要意义。本文作者在试验中摸索出一种快速提取DNA做PCR模板的方法,在转基因鼠的鉴定中取得了较好的结果。现将结果报告如下,并将其与其它几种方法进行了比较。

提高PCR扩增大DNA片段的特异性和产量

聚合酶链式反应(PCR)技术仅产生数年,却以惊人的速度广泛应用于分子生物学各个领域。它能快速、特异地扩增出任何所希望的目的基因或DNA片段,用于基因克隆、测序、突变体和重组体构建、基因表达调控的研究、基因多态性分析、遗传病和传染病诊断、肿瘤机制的探查、法医鉴定等诸多方面。目前PCR扩增DNA片段长度可达到近50kb,这在生物学研究特别是在基因组图谱的绘制和测序中将起到革命性作用。扩增片段的能力达到近20～50kb,也将具有其它潜在的应用价值,如可以分离出完整的基因。