吉非替尼联合二甲双胍对EGFR-TKIs原发性耐药非小细胞肺癌H1975细胞的抑制作用及其机制研究

目的探讨吉非替尼联合二甲双胍对肺癌H1975细胞的抑制增效作用及其机制。方法采用MTT、克隆形成实验观察吉非替尼与二甲双胍单用及联用对原发性耐药非小细胞肺癌H1975细胞增殖活性的影响;Matrigel包被的Transwell小室检测细胞侵袭能力;划痕愈合实验检测细胞迁移能力;TUNEL检测细胞凋亡率;Western blot、免疫荧光法检测凋亡和上皮细胞-间充质转化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)相关蛋白的变化。结果吉非替尼联合二甲双胍组对H1975细胞增殖、侵袭及迁移抑制效应优于吉非替尼组,协同增效作用明显(P<0.05);吉非替尼和二甲双胍单用时较对照组的细胞凋亡率增加,当两者联合作用时细胞凋亡率增加更显著(P<0.05),且明显下调抗凋亡相关蛋白(Bcl-xl、Mcl-1)和上调促凋亡蛋白Bax;两药联用明显逆转H1975细胞EMT的发生;间质细胞相关蛋白(Vimentin、N-cadherin、Slug、Snail)表达水平降低,上皮细胞相关蛋白E-cadherin表达水平升高。结论吉非替尼联合二甲双胍可显著抑制EGFR-TKIs原发性耐药非小细胞肺癌H1975细胞的增殖、侵袭和迁移,促使肿瘤细胞凋亡;其机制可能通过激活线粒体凋亡途径及逆转EMT的发生来发挥抗肿瘤作用。

二甲双胍对生物电场下肺癌H1975细胞增殖和定向迁移的影响

目的探讨二甲双胍对生物电场诱导的肺癌H1975细胞定向迁移和增殖的作用及其分子机制。方法利用外加直流电构建了生物电场诱导肺癌H1975细胞定向迁移的实验模型,观察不同电场梯度及实验分组下H1975细胞的迁移及增殖情况。实验分组:空白对照组、二甲双胍处理组(5 mmol/L二甲双胍预处理48 h)、电场处理组(100 mV/mm加电处理1 h)、二甲双胍联合电场处理组(5 mmol/L二甲双胍预处理48 h后,100 mV/mm加电处理1 h)。采用ImageXpress细胞成像微孔板检测仪采集肺癌H1975细胞运动图像,使用Image J软件分析细胞运动速度及运动定向性变化;Ki67荧光染色法检测细胞增殖能力;Western blot、免疫荧光法检测增殖和上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关蛋白的变化。结果在不同水平电场刺激作用下,H1975细胞的运动能力及定向性随着电场强度升高而不断增强(P<0.05),电场刺激还可增强细胞增殖能力并诱导EMT。在加入二甲双胍与电场联合处理后,细胞运动速度较电场处理组下降(P<0.05),趋电性减弱(P<0.01),细胞增殖能力受到抑制,同时E-cadherin表达水平较电场处理组升高(P<0.01)、Vimentin表达水平降低(P<0.05),提示二甲双胍能够逆转电场诱导的EMT。Western blot结果显示电场刺激可上调p-AKT、p-ERK、p-STAT3的表达水平,而加入二甲双胍后可下调相关蛋白的表达。结论二甲双胍可通过抑制AKT/ERK信号通路及逆转EMT,抑制生物电场诱导的肺癌H1975细胞迁移和增殖。

不同剂量吉非替尼对博莱霉素所致大鼠肺纤维化影响的比较

目的对比观察不同剂量吉非替尼对博莱霉素所致大鼠肺纤维化的影响。方法将75只雄性SD大鼠分为5组:对照组、博莱霉素组、低剂量吉非替尼联用组、中剂量吉非替尼联用组、高剂量吉非替尼联用组,每组15只。观察大鼠存活情况,第21天时杀鼠取左肺石蜡切片行HE染色及Masson染色,右肺ELISA方法检测羟脯氨酸含量。结果高剂量吉非替尼联用组能明显加重博莱霉素所致肺纤维化,Ashcroft评分、肺组织胶原沉积及羟脯氨酸含量明显增多(P<0.05)。中等剂量吉非替尼联用组Ashcroft评分较博莱霉素组差异无统计学意义(P>0.05),羟脯氨酸含量明显增加(P<0.05)。而低剂量吉非替尼联用组各项指标与博莱霉素组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论吉非替尼能加重博莱霉素所致大鼠肺纤维化,且吉非替尼剂量越大,大鼠肺纤维化程度越高。

根据转录组学分析奥希替尼获得性耐药机制的研究

目的根据转录组测序技术分析介导肺癌奥希替尼耐药的信号通路,发现潜在干预靶点。方法体外构建肺癌奥希替尼一线/二线治疗模式下配对的敏感/耐药细胞株,采用高通量测序技术检测耐药前后细胞转录本表达量并使用R-package CORNAS筛选差异表达基因,借助Venny在线工具分析两组配对细胞株差异表达基因的交集,运用DAVID Bioinformatics Resources数据库分别对两种耐药模式下共有差异基因和特有差异基因进行京都基因与基因组百科全书(kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)信号通路和基因本体(gene ontology,GO)功能富集分析。采用STRING 12.0数据库分析关键通路富集基因相互作用关系及靶点分子,借助chiplot在线工具绘制分子相互作用网络图。结果两组配对细胞株共有差异表达基因显著富集在Cell Cycle通路,一线治疗耐药特有差异基因富集在Cell Cycle和Ribosome biogenesis in eukaryotes通路,二线治疗耐药特有差异基因富集在MAPK signaling通路;GO富集分析发现共有差异表达基因参与cell division,分子功能是ATP binding,一、二线治疗耐药特有差异表达基因分别参与了rRNA processing和inflammatory response生物过程,主要分子功能分别是RNA binding和Protein binding;共筛选出5种关键靶点分子,包括CCNB1(共有)、CDC25A和NOP56(一线耐药特有)、JUN和MYC(二线耐药特有)。结论奥希替尼一线或二线治疗模式下共同及特有的潜在获得性耐药机制,为克服奥希替尼耐药提供潜在的治疗靶点。

水飞蓟宾增敏克唑替尼抑制间变性淋巴瘤激酶阳性非小细胞肺癌的作用及机制

目的研究水飞蓟宾联合克唑替尼对间变性淋巴瘤激酶（ALK）基因阳性非小细胞肺癌（NSCLC）细胞的增殖抑制作用和机制。方法采用单加水飞蓟宾、单加克唑替尼或两药联合作用于NSCLC细胞株H2228和H3122，以四甲基偶氮唑蓝（MTT）法和克隆形成实验检测细胞的增殖活性，以划痕实验和侵袭实验检测细胞的迁移和侵袭能力，以免疫荧光实验检测细胞上皮间质转化（EMT）标志蛋白E-Cadherin和Vimentin的表达情况，以Westernblot法检测细胞中ALK、P-ALK、E-Cadherin和Vimentin蛋白的表达变化。将H2228细胞悬液注射入裸鼠皮下，构建裸鼠移植瘤模型，观察移植瘤的生长情况。结果MTr法检测结果显示，当水飞蓟宾浓度为100μmol／L时，H2228和H3122细胞的存活率分别为（88．38±4．10）％和（72．27±3．62）％，对细胞的增殖活性影响较小。当100μmol／L的水飞蓟宾与克唑替尼联合使用时，克唑替尼对H2228细胞的I50从（917．10±7．75）nmoL／L下降到（238．73±7．67）nmol／L，对H3122细胞的I50从（472．50＋15．70）nmol／L下降到（206．10±12．01）nmol／L，联合用药后克唑替尼对H2228和H3122细胞的I50明显降低。与对照组H2228细胞比较，100μmol／L水飞蓟宾组、400nmol／L克唑替尼组、100μmol／L水飞蓟宾联合400nmoL／L克唑替尼组H2228细胞的克隆形成率分别为（83．34±2．72）％、（69．42±3．06）％和（27．32±1．42）％；与对照组H3122细胞比较，100μmoL／L水飞蓟宾组、400nmol／L克唑替尼组、100μmol／L水飞蓟宾联合400nmol／L克唑替尼组H2228细胞的克隆形成率分别为（84．45±5．67）％、（45．02±5．83）％和（17．43±3．83）％。水飞蓟宾联合克唑替尼后，H2228和H3122细胞的克隆形成能力均明显下降（均P〈0．01）。迁移和侵袭实验结果显示．水飞蓟宾与克唑替尼联用能明显抑制H2228细胞的迁移和侵袭（均P〈O．01）。Westernblot法检测结果显示，无论单用水飞蓟宾、还是联合克唑替尼，H2228细胞中E-Cadherin蛋白的表达明显升高，p-ALK、Vimentin蛋白表达明显下降，ALK总蛋白的表达无明显变化。单用克唑替尼组和联合用药组的肿瘤重量分别为（9．40±2．58）g和（4．58±1．07）g，联合用药组的抑瘤效果明显好于克唑替尼单药组（P〈0．05）。结论水飞蓟宾可增强克唑替尼对ALK阳性NSCLC细胞的增殖抑制作用，其机制可能与两药联用能进一步降低ALK阳性NSCLC细胞的ALK活性，促进间质上皮转化（MET）的发生有关。

HDAC3影响二甲双胍抑制非小细胞肺癌增殖的实验研究

目的:探讨二甲双胍对非小细胞肺癌增殖的影响,并阐明HDAC3在其中的作用。方法:在体外用不同浓度的二甲双胍对人非小细胞肺癌细胞系(H460细胞、H1299细胞及A549细胞)进行处理,通过CCK-8以及Ki-67检测其对细胞增殖的影响。建立肺癌细胞(H1299细胞与A549细胞)移植瘤模型检测二甲双胍在体内的抗肿瘤效应。慢病毒介导H1299细胞过表达HDAC3,结合蛋白质组学分析探究HDAC3过表达影响二甲双胍抑制肺癌细胞增殖的效应和潜在机制。结果:体外实验表明,二甲双胍呈剂量依赖性抑制多种非小细胞肺癌细胞系的存活率和增殖率。体内实验证实,二甲双胍能显著降低移植瘤的体积与重量,同时对小鼠体重无明显影响。而且,二甲双胍可抑制肺癌细胞中HDAC3的表达,而HDAC3过表达则显著降低了二甲双胍抑制肺癌细胞增殖的效应。蛋白质组学分析提示,H1299细胞过表达HDAC3后经二甲双胍处理所筛选的差异蛋白主要富集到HIF-1通路以及糖代谢相关通路。结论:二甲双胍在体外、体内均具有抗肿瘤效应,过表达HDAC3会抑制该效应,靶向HDAC3可能成为联合二甲双胍治疗非小细胞肺癌的新策略。

2-脱氧葡萄糖逆转非小细胞肺癌细胞对奥希替尼继发性耐药的作用及机制

目的探究2-脱氧葡萄糖(2-DG)逆转非小细胞肺癌细胞对奥希替尼继发性耐药的作用及机制。方法将非小细胞肺癌(NSCLC)细胞株H1975(购自美国国家细胞库)通过体外诱导法处理后建立奥希替尼继发性耐药肺癌细胞株H1975-OR,用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法、克隆形成实验、Ki67蛋白荧光染色、凋亡通路相关蛋白表达水平检测,评估细胞株H1975-OR对奥希替尼的耐药性;通过测定细胞株H1975和H1975-OR培养基上清液中乳酸含量确定细胞糖酵解水平;Western blot法检测糖酵解关键酶(己糖激酶2、葡萄糖转运子1、磷酸化丙酮酸激酶M2亚型)及凋亡相关蛋白(B淋巴细胞瘤-2、Bcl-2蛋白相互作用的细胞死亡调解子)的表达;分为空白对照、2-脱氧葡萄糖(4 mmol/L)单药处理、奥希替尼(3μmol/L)单药处理、2-脱氧葡萄糖(4 mmol/L)+奥希替尼(3μmol/L)联合处理组,用流式细胞分析仪检测药物处理后的细胞凋亡率,评估药物的促凋亡能力。采用SPSS 16.0统计软件,用独立t检验对结果进行统计分析。结果奥希替尼敏感细胞株H1975比奥希替尼继发性耐药细胞株H1975-OR的糖酵解水平低[乳酸产生量分别为(21.0±0.9)和(26.5±2.8)mmol/(L×10^4cells),P<0.05];细胞株H1975-OR经4 mmol/L的2-脱氧葡萄糖处理后可逆转其对奥希替尼的继发性耐药,对奥希替尼的IC50值由(7.0±1.9)μmol/L降至(1.4±0.1)μmol/L,接近敏感细胞株H1975对奥希替尼的IC50值(1.0±0.2)μmol/L;细胞株H1975-OR经2-脱氧葡萄糖+奥希替尼联合处理后细胞凋亡率为(26.7±2.4)%,显著高于对照组的(5.1±0.7)%、2-脱氧葡萄糖单药处理组的(6.1±2.5)%和奥希替尼单药处理组的(11.4±2.7)%(均P<0.05);细胞株H1975-OR经2-脱氧葡萄糖+奥希替尼联合处理后,BIM蛋白表达为(177.8±28.1)%,显著高于对照组的(100.0±0)%(P<0.05);Bcl-2蛋白表达为(24.6±5.2)%,显著低于对照组的(100±0)%(P<0.05)。结论2-脱氧葡萄糖可以逆转NSCLC细胞对奥希替尼继发性耐药,其机制可能与抑制细胞糖酵解进而诱导凋亡增加有关。

IL-6致非小细胞肺癌PD-1抑制剂治疗抵抗的效应和机制研究

目的:通过回顾性分析晚期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者外周血白细胞介素-6(in-terleukin6,IL-6)水平与程序性细胞死亡蛋白-1(programmedcelldeathprotein-1,PD-1)抑制剂疗效的相关性,初步探讨IL-6致PD-1抑制剂治疗抵抗的效应和机制。方法:纳入接受PD-1抑制剂治疗且有治疗前外周血IL-6检测结果的晚期NSCLC患者,分析IL-6水平与客观缓解率(objectiveresponserate,ORR)、持续临床获益(durableclinicalbene-fit,DCB)、无持续临床获益(non-durableclinicalbenefit,NDB)的相关性。通过CCK-8及Ki67实验检测IL-6对T细胞杀伤肿瘤细胞效应的影响,Westernblot检测目的蛋白的表达情况。结果:30例晚期NSCLC患者中DCB组IL-6水平显著低于NDB组(中位值4.60pg/mLvs12.88pg/mL,P=0.002)。低IL-6组(<7pg/mL,n=10)与高IL-6组(≥7 pg/mL,n=20)相比,DCB占比更大(100%vs50%,P=0.002),ORR更高(65%vs20%,P=0.025),中位无进展生存期更长(未达到vs8个月,P=0.007)。CCK-8及Ki67检测结果示,外加IL-6可显著抑制T细胞对H1299、A549细胞的杀伤效果。Westernblot检测发现,外加IL-6可显著上调p-STAT3、p-AKT水平,并显著下调STING和p-TBK1表达。结论:外周血IL-6水平与晚期NSCLC患者PD-1抑制剂治疗效果显著负相关。IL-6可能通过活化STAT3-AKT通路进而抑制STING-TBK1信号,减弱T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤。