帕立骨化醇抑制糖尿病肾病小鼠肾组织炎性反应研究

目的利用2型糖尿病肾病db/db小鼠模型,探讨维生素受体激动剂帕立骨化醇对糖尿病肾病小鼠肾组织炎性反应的抑制作用。方法 2015年1—11月,将60只雄性5周龄SPF级C57BLKS/J db/db小鼠采用随机数字表法分为db/db-对照组(N组,n=20)、db/db-二甲基亚砜组(D组,n=20)、db/db-帕立骨化醇组(P组,n=20),同窝出生的db/m小鼠作为正常对照组(C组,n=20)。10周龄时P组小鼠腹腔注射0.3μg/kg帕立骨化醇,隔日1次,D组小鼠腹腔注射与P组等量的二甲基亚砜+0.9%氯化钠溶液,N组和C组小鼠不做处理。干预12周后测定小鼠体质量、空腹血糖、24 h尿蛋白定量;留取肾组织并进行肾组织病理学检查。应用实时荧光定量PCR、Western blotting和免疫组化检测炎性因子白介素(IL)-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)mRNA及其蛋白的表达水平。结果干预12周后,4组小鼠体质量、空腹血糖水平、24 h尿蛋白定量比较,差异均有统计学意义(P<0.01);其中N组、D组和P组小鼠体质量、空腹血糖水平和24 h尿蛋白定量高于C组,P组小鼠24 h尿蛋白定量低于N组和D组(P<0.05)。病理学检查显示:C组肾小球及肾小管结构完整清晰;N组和D组可见肾小管间质局部炎性细胞浸润,与C组比较,炎性反应明显;P组肾脏病理改变较N组和D组减轻,炎性反应减轻。4组IL-6、TNF-αmRNA及其蛋白表达水平比较,差异均有统计学意义(P<0.01);其中N组、D组、P组IL-6、TNF-αmRNA及其蛋白表达水平均高于C组,P组IL-6、TNF-αmRNA及其蛋白表达水平均低于N组和D组(P<0.05)。免疫组化结果显示,与C组比较,N组和D组肾组织IL-6、TNF-α表达上调;而P组肾组织IL-6、TNF-α表达较N组和D组下调。结论帕立骨化醇可减轻糖尿病肾病小鼠肾组织炎性反应,且该作用可能不依赖于降糖。

帕立骨化醇对糖尿病肾病小鼠肾小管上皮间质转化的作用研究

目的 探讨帕立骨化醇对糖尿病肾病小鼠肾小管上皮间质转化（EMT）的作用。方法 选取20只db/m小鼠作为正常对照组（A组）,将60只db/db小鼠随机编号分组,其中1-20号小鼠为糖尿病对照组（B组）、21-40号小鼠为糖尿病DMSO组（C组）、41-60号小鼠为帕立骨化醇治疗组（D组）。均于小鼠10周龄时分别进行如下处理：D组小鼠给予帕立骨化醇腹腔注射,C组小鼠给予同等量二甲基亚砜腹腔注射,共治疗8周;A组和B组小鼠不作任何处理。帕立骨化醇连续干预8周后,测量各组小鼠体质量和血、尿生化指标;采用western blot法及实时荧光定量PCR检测肾组织TGF-β1、α-SMA、E-cadherin表达情况。结果 B组、C组和D组小鼠体质量、空腹血糖及血肌酐、尿素氮、尿蛋白水平高于A组（P〈0.05）;B组、C组和D组小鼠体质量和空腹血糖比较,差异无统计学意义（P〉0.05）;B组和C组小鼠血肌酐、尿素氮、尿蛋白水平高于D组（P〈0.05）。B、C、D组小鼠肾组织TGF-β1、α-SMA蛋白和mRNA相对表达量高于A组,E-cadherin蛋白和mRNA相对表达量低于A组（P〈0.05）;B、C组小鼠肾组织TGF-β1、α-SMA蛋白和mRNA相对表达量高于D组,E-cadherin蛋白和mRNA相对表达量低于D组（P〈0.05）。免疫组化结果显示,与A组比较,B组和C组小鼠肾组织TGF-β1、α-SMA表达上调,E-cadherin表达下调;而与B组和C组比较,D组小鼠肾组织TGF-β1、α-SMA表达下调,E-cadherin表达上调。结论 帕立骨化醇可抑制DN小鼠肾小管上皮细胞EMT,其作用机制可能与抑制TGF-β1表达有关。

维生素D受体在糖尿病肾病足细胞损伤及蛋白尿缓解中的作用

目的探讨维生素D受体(VDR)在糖尿病肾病(DKD)足细胞中的表达水平及在足细胞损伤及蛋白尿缓解中的作用。方法(1)本研究纳入了65例诊断患有2型糖尿病(伴或不伴蛋白尿)的患者,并纳入了25例年龄和性别相匹配的健康体检者为对照组。根据白蛋白/肌酐(ACR)的尿排泄比例对2型糖尿病患者进行分组,分别为无蛋白尿(ACR<30 mg/g,n=24)、微量白蛋白尿(ACR 30~300 mg/g,n=18)和临床蛋白尿(ACR>300 mg/g,n=23)。另选择25例经肾活检确诊的DKD患者作为DKD组。正常肾脏组织标本均取自泌尿外科同一时期肾脏肿瘤切除患者10例。将各组检测指标进行对比,同时采用实时定量PCR、ELISA法和免疫组化法检测VDR在各组患者的血液、尿液样本和肾脏组织中的表达情况,以及使用Pearson相关分析分析VDR与尿蛋白的相关性。(2)在2型糖尿病肾病小鼠模型中对上述结果进行验证,将遗传背景均为C57BLKs/J的雄性db/db小鼠及同窝出生的db/m小鼠,随机分为正常对照组(A组)、DKD对照组(B组)、DKD二甲基亚砜处理组(C组)、DKD帕立骨化醇(VDR激动剂)处理组(D组),C、D组连续腹腔注射处理8周,对照组不做任何处理。小鼠10周龄时开始连续干预8周,在小鼠22周龄(开始干预后12周)检测各组小鼠体重、血、尿生化指标对比;Western印迹法检测β⁃catenin、VDR的变化;免疫荧光观察足细胞标志蛋白podocin及足细胞损伤蛋白α⁃SMA的表达变化。结果(1)与正常健康对照组相比,无蛋白尿组、微量白蛋白尿组和临床蛋白尿组的糖尿病患者血浆中VDR的mRNA和蛋白水平均较低(均P<0.05);与无蛋白尿组的糖尿病患者相比,微量白蛋白尿组和临床蛋白尿组的糖尿病患者血浆中VDR的mRNA和蛋白水平均较低(均P<0.05)。(2)与正常健康对照组相比,无蛋白尿糖尿病组和DKD组患者血浆中VDR的mRNA和蛋白水平均较低(均P<0.05);与无蛋白尿糖尿病组患者相比,DKD组患者血浆中VDR的mRNA和蛋白水平亦较低(均P<0.05)。(3)免疫组化结果显示,DKD组肾组织中VDR的表达明显少于正常对照组。(4)DKD患者血浆中VDR mRNA相对水平与ACR呈负相关(r=-0.342,P<0.05)。(5)各组尿液上清液中VDR的水平与血浆中的水平呈相反趋势。(6)Western印迹结果显示,B组、C组肾小球足细胞β⁃catenin蛋白表达高于D组(均P<0.05),VDR蛋白的表达低于D组(均P<0.05);免疫荧光结果显示,B组、C组肾小球足细胞podocin的表达低于D组(均P<0.05),α⁃SMA的表达高于D组(均P<0.05)。结论VDR高表达缓解DKD足细胞损伤及蛋白尿。